基于藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性技術(shù)的綜合型實(shí)驗(yàn)探索

黃 瑾，吳麗莉，徐仲玉

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237）

0 引言

在我國全面推動(dòng)實(shí)施高?！半p一流”建設(shè)的戰(zhàn)略背景下，提高本科教育人才的綜合素質(zhì)是新形勢下高等教育實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵式發(fā)展的核心任務(wù)［1］。圍繞這一核心任務(wù)開展的高等教育課程設(shè)計(jì)與教學(xué)實(shí)踐需與時(shí)俱進(jìn)，以任務(wù)目標(biāo)為導(dǎo)向，開展相應(yīng)的教學(xué)改革，設(shè)計(jì)重體驗(yàn)、易交互的課程教學(xué)內(nèi)容是當(dāng)前本科教學(xué)課程改革的主要方向［2-4］。

2018 新修訂的“藥學(xué)類專業(yè)教學(xué)質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)”［5］中明確提出藥學(xué)類專業(yè)人才培養(yǎng)需與藥物研發(fā)、生產(chǎn)、流通、管理、質(zhì)量控制和藥學(xué)服務(wù)等相關(guān)。結(jié)合我國高等教育素質(zhì)人才培養(yǎng)及藥學(xué)專業(yè)人才培養(yǎng)要求，藥物化學(xué)生物學(xué)作為藥學(xué)專業(yè)人才培養(yǎng)的核心課程，在教學(xué)實(shí)踐中將藥物化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)新技術(shù)設(shè)計(jì)成多種綜合型實(shí)驗(yàn)，推廣并深入扎根到藥學(xué)相關(guān)專業(yè)本科學(xué)生的學(xué)習(xí)及科研實(shí)踐中，將有助于學(xué)生形成科學(xué)概念、認(rèn)識科學(xué)規(guī)律、掌握科學(xué)方法［6-7］。在對本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容和低年級研究生的實(shí)驗(yàn)操作技能進(jìn)行充分調(diào)研的基礎(chǔ)上，以“科研反哺教學(xué)，教學(xué)促進(jìn)科研”［8］的教學(xué)改革思想為出發(fā)點(diǎn)，將藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)的穩(wěn)定性（drug affinityresponsive target stability，DARTS）技術(shù)對小分子藥物靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證的相關(guān)科研內(nèi)容進(jìn)行了系統(tǒng)梳理與整合，設(shè)計(jì)了在鏈霉菌蛋白酶作用下陽性小分子T0901317 有效增強(qiáng)RORγt靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的綜合型實(shí)驗(yàn)。

DARTS技術(shù)的概念由Lomenick等［9］于2009 年首次提出，可用于藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和鑒定。藥物靶標(biāo)是存在于生命機(jī)體內(nèi)能與藥物分子發(fā)生相互作用并產(chǎn)生藥效的特定生物大分子，其發(fā)現(xiàn)與確定是新藥研發(fā)的核心和關(guān)鍵［10］。DARTS技術(shù)通過觀察小分子藥物與蛋白酶處理后蛋白樣品中受小分子藥物保護(hù)的蛋白含量變化，可有效確證細(xì)胞內(nèi)小分子藥物與靶標(biāo)蛋白之間的相互作用［11］。

經(jīng)過近10 年的發(fā)展，DARTS 技術(shù)無需進(jìn)行藥物保護(hù)性修飾且無藥物活性依賴性等優(yōu)點(diǎn)引起了廣大科研工作者的廣泛關(guān)注，其在現(xiàn)代藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和確證研究中的應(yīng)用日益廣泛，如白藜蘆醇、雷帕霉素、雙硫侖（disulfiram）等多個(gè)經(jīng)典小分子藥物的靶標(biāo)蛋白已通過DARTS 技術(shù)確證［9，12-13］。然而這一新技術(shù)在本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)中卻鮮有涉及，為與時(shí)俱進(jìn)，切實(shí)做好藥學(xué)本科專業(yè)的實(shí)踐教學(xué)工作，探索將該新技術(shù)應(yīng)用于藥物化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐，在實(shí)際教學(xué)中注重引導(dǎo)學(xué)生用理論知識來分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)踐表明，實(shí)驗(yàn)整體流程規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)，有效激發(fā)了學(xué)生對于新知識新技術(shù)的強(qiáng)烈探索欲望，增強(qiáng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)規(guī)范性操作意識，進(jìn)一步拓展了學(xué)生的知識領(lǐng)域并提高了學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力。

1 基于科研項(xiàng)目流程的DARTS 綜合型實(shí)驗(yàn)原理及設(shè)計(jì)思路

1.1 DARTS實(shí)驗(yàn)原理

DARTS實(shí)驗(yàn)原理具體如下：在蛋白酶存在時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白易被蛋白酶水解，而小分子藥物與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，由于疏水性、氫鍵或靜電相互作用的變化常誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象形態(tài)改變，使靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性增加，蛋白酶對靶標(biāo)蛋白的水解作用減弱［13］（見圖1）。因此通過觀察蛋白酶處理后細(xì)胞樣品中受小分子保護(hù)的蛋白含量變化，可發(fā)現(xiàn)小分子藥物的潛在作用靶點(diǎn)，確證小分子藥物與靶標(biāo)蛋白的相互作用（見圖2）。

圖1 小分子誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性變化示意圖

圖2 DARTS原理示意圖

1.2 DARTS綜合型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

綜合考慮本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的可操作性，實(shí)驗(yàn)選用本課題組科研實(shí)驗(yàn)已多次驗(yàn)證過的RORγt 陽性小分子抑制劑T0901317 為活性小分子，以其在Jurkat細(xì)胞中可穩(wěn)定維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）蛋白為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了教學(xué)案例，實(shí)驗(yàn)主要操作流程如圖3 所示，具體實(shí)驗(yàn)過程分為細(xì)胞內(nèi)蛋白提取與濃度測定、藥物與蛋白結(jié)合、細(xì)胞蛋白混合物的酶解及靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性檢測，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程安排8 學(xué)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中注重實(shí)際動(dòng)手能力與合作精神的培養(yǎng)，因此安排以2 人為1 小組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 DARTS實(shí)驗(yàn)操作流程圖

DARTS 實(shí)驗(yàn)中，蛋白酶的選擇是操作的關(guān)鍵之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用于DARTS實(shí)驗(yàn)的蛋白酶主要有枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）、嗜熱菌蛋白酶（thermoysin）與鏈霉菌蛋白酶（pronase）［14-16］。枯草桿菌蛋白酶在化工、醫(yī)藥和釀造等多個(gè)領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用，但其成分復(fù)雜，且需在堿性條件下使用［17-18］；嗜熱菌蛋白酶在使用時(shí)需加入鋅離子和鈣離子維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，且主要酶解非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)底物［19］，常導(dǎo)致較高的假陽性［16］；鏈霉菌蛋白酶在中性pH下具有較強(qiáng)活性，是現(xiàn)今DARTS 實(shí)驗(yàn)中優(yōu)先使用的蛋白酶［20］。故本實(shí)驗(yàn)中選用鏈霉菌蛋白酶進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式冷凍離心機(jī)Eppendorf5427R（艾本德中國有限公司）；普通金屬浴（上海碩盟生物技術(shù)有限公司）；蛋白電泳儀EPS3000（上海天能科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀BioTeKSynergy Neo HTS（美國伯騰儀器有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)主要材料及試劑

人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat 細(xì)胞）（中科院上海生命科學(xué)研究院購）；哺乳動(dòng)物蛋白提取及非變性細(xì)胞裂解緩沖液（mammalian protein extraction reagent，M-PER）、PBS 磷酸緩沖液、蛋白Marker（Thermo Scientific 公司）；改良型RPMI-1640 培養(yǎng)皿（美國Hyclone 公司）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（陶素生化有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；鏈霉菌蛋白酶（上海源葉有限公司）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、考馬斯亮藍(lán)染色液及脫色液（碧云天生物科技有限公司）；12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）預(yù)制膠（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）。

3 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

3.1 細(xì)胞內(nèi)蛋白提取與濃度測定

Jurkat 細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640 培養(yǎng)皿中，于95%濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度為2 ×106個(gè)／mL 時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代時(shí)，將含有Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)基1 500 r／min、5 min 離心，去舊培養(yǎng)基后重新加入新鮮培養(yǎng)基懸浮，1∶5傳代至5 個(gè)T25瓶，添加完全培養(yǎng)基至10 mL／瓶即可。

于4 ℃、1 500 r／min、5 min 離心培養(yǎng)好的Jurkat細(xì)胞中加入適量預(yù)冷的PBS，吹勻后4 ℃、1 500 r／min、2 min離心進(jìn)行細(xì)胞清洗，重復(fù)2～3 次。加入預(yù)冷的M-PER（含1%蛋白酶抑制劑與1%磷酸酶抑制劑），溫和混勻置于冰上靜置裂解15 min，12 000 r／min、4 ℃、離心10 min，取上清置于新離心管中，利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)蛋白濃度用M-PER緩沖液稀釋至1.5 g／L備用。

注意事項(xiàng)：為避免蛋白降解，所有操作需在冰上或4 ℃環(huán)境下操作。以上步驟的實(shí)驗(yàn)樣品由教師提前準(zhǔn)備完成。

3.2 藥物與蛋白結(jié)合

按蛋白酶的加入與否，將上述提取蛋白（1.5 g／L）分為樣品及對照組共7 組，每組200 μL，每組總蛋白300 μg。樣品組分別加入終濃度0、1.25、2.5、5、10、20 μmol／L的小分子化合物T0901317，化合物濃度為0的樣品組及對照組需加入等體積DMSO，混勻后于冰上孵育1 h，轉(zhuǎn)移至40 ℃金屬浴迅速升溫。

3.3 細(xì)胞蛋白混合物的酶解

上述樣品置于40 ℃金屬浴上預(yù)熱10 min，隨后向各樣品組中分別加入相應(yīng)量的鏈霉菌蛋白酶PBS 溶液（鏈霉菌蛋白酶濃度為5 mg／mL，酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50），40 ℃金屬浴上酶解15 min 后立即加入50 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液終止酶解反應(yīng)。

注意事項(xiàng)：鏈霉菌蛋白酶的最適酶解溫度為40℃，小分子與蛋白混合物混勻后迅速升溫至40 ℃有助于酶解反應(yīng)，酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí)需立即取樣用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性檢測

靶標(biāo)蛋白穩(wěn)定性檢測采用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)凝膠染色法進(jìn)行。具體實(shí)驗(yàn)操作為：將預(yù)制的SDSPAGE膠板，放入蛋白電泳槽，每管樣品取20 μL沸水中加熱3 min離心后上樣，電泳槽中加入緩沖液，接通電源后電泳，電泳結(jié)束后，取出膠板染色1 h后脫色至蛋白條帶清晰，對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)中，RORγt的蛋白分子量為30 kDa，選用12%的預(yù)制膠可以對25～35 kDa分子量的蛋白進(jìn)行較好的分離。

注意事項(xiàng)：蛋白電泳結(jié)果是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵，因此在本部分實(shí)驗(yàn)過程中需重點(diǎn)關(guān)注以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：①搭置SDS-PAGE電泳凝膠裝置后需對電泳槽進(jìn)行檢漏；②打開電泳裝置電壓前，需確保電泳槽正負(fù)電極是否連接正確；③電泳過程中需將電泳槽至于冰水浴中，并建議設(shè)置電壓90 V、電流45 mA、120 min勻速跑至臨近膠板底部，避免高電壓產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致膠層變形。

4 結(jié)果與分析

4.1 蛋白酶濃度對DRATS實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

向準(zhǔn)備好的系列樣品中加入不同濃度的鏈霉菌蛋白酶（酶與蛋白質(zhì)量比1∶1、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），參照酶解操作步驟進(jìn)行酶解，于酶解15 min后立即取樣電泳，染色、脫色后的膠圖結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶與蛋白質(zhì)量比對酶解結(jié)果的影響

從圖4 中可見，鏈霉菌蛋白酶可以水解蛋白混合物，蛋白質(zhì)被水解的程度隨酶濃度的提高明顯增加。酶與蛋白質(zhì)量比為1∶1、1∶10，1∶20，1∶30 時(shí)，蛋白幾乎全部被水解；當(dāng)酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50 時(shí)，酶解作用較溫和，有穩(wěn)定蛋白條帶（如圖中星號所指示）出現(xiàn)，故將酶與蛋白質(zhì)量比1 ∶50 作為檢測小分子化合物T0901317 與靶標(biāo)相結(jié)合的最適酶解濃度。

4.2 蛋白酶解時(shí)間對DRATS實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

參照酶解操作步驟，將酶與蛋白質(zhì)量比設(shè)定為1∶50，改變酶解時(shí)間，分別于酶解35、30、25、20、15、10 min后立即取樣電泳，染色、脫色后的膠圖結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時(shí)間對酶解結(jié)果的影響

圖5 顯示當(dāng)酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50 時(shí)，酶解時(shí)間超過25 min后，幾乎所有的蛋白均被完全水解，未見條帶（如圖中箭頭所指示），酶解10 min 時(shí)，剩余的蛋白條帶較多，不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。酶解15 min 和20 min的結(jié)果無明顯區(qū)別，考慮本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)組別較多，為節(jié)約時(shí)間，故選用酶解時(shí)間為15 min 作為最適酶解時(shí)間。

4.3 小分子化合物T0901317 與靶標(biāo)蛋白RORγt 相結(jié)合的檢測實(shí)驗(yàn)

確定了酶解濃度與酶解時(shí)間后，將不同濃度小分子藥物與細(xì)胞裂解液孵育、酶解后，通過SDS-PAGE檢測小分子藥物在細(xì)胞中的潛在作用靶標(biāo)，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同濃度T0901317與細(xì)胞裂解液孵育酶解后SDS-PAGE結(jié)果

圖6 結(jié)果顯示，當(dāng)酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50、酶解時(shí)間15 min時(shí)，可看到在30 kDa附近有一蛋白條帶隨T0901317 濃度的增加而變粗，說明了T0901317 可濃度依賴性地增加該條帶蛋白的酶解穩(wěn)定性。該條帶蛋白已經(jīng)過質(zhì)譜鑒定為RORγt。

5 結(jié)語

為社會(huì)培養(yǎng)更多能從事藥學(xué)基礎(chǔ)性研究與創(chuàng)新藥物研究，具有原始創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)研發(fā)能力的高級藥學(xué)人才是現(xiàn)階段高校藥學(xué)專業(yè)人才培養(yǎng)的重要目標(biāo)。藥學(xué)是一門綜合性及實(shí)踐性均極強(qiáng)的學(xué)科，專業(yè)知識容量大，相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速，這一培養(yǎng)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)需實(shí)時(shí)輔以專業(yè)課程尤其是實(shí)踐類課程的全面改革提升，及時(shí)將科研前沿新知識轉(zhuǎn)化為本科實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容。DARTS技術(shù)在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及確證研究中的優(yōu)勢日益明顯，有著日益廣泛的應(yīng)用。將DARTS 技術(shù)這一藥物發(fā)現(xiàn)研究領(lǐng)域中的前沿成果引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，讓學(xué)生了解及掌握這項(xiàng)藥物研發(fā)新技術(shù)的起源、原理及實(shí)際應(yīng)用，可有效豐富學(xué)生的專業(yè)理論知識、激發(fā)學(xué)習(xí)熱情、提升發(fā)現(xiàn)問題及分析解決問題的能力，培養(yǎng)學(xué)生的自主創(chuàng)新意識。