椰心葉甲、椰子織蛾腸道菌群多樣性分析

李紫成，呂寶乾，盧 輝，唐繼洪，何 杏，蘇 豪

1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058

椰心葉甲BrontispalongissimaGestro是我國(guó)一種重要的危險(xiǎn)性外來(lái)有害生物，原產(chǎn)于印度尼西亞，2002年入侵中國(guó)海南并暴發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重影響了棕櫚植物種植業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)(呂寶乾等，2005)。椰心葉甲危害椰樹(shù)CocosnuciferaL.等棕櫚植物的葉片，對(duì)未展開(kāi)葉片危害尤其嚴(yán)重。同時(shí)，椰心葉甲具有繁殖速度快、破壞性強(qiáng)和防治難度大等特點(diǎn)。

椰子織蛾OpisinaarenosellaWalker是棕櫚科植物上重要的害蟲(李后魂等，2014)。雌蛾在椰子葉背面產(chǎn)下卵塊，幼蟲取食老葉表皮及葉肉，并在體外構(gòu)造出絲和糞便的甬道，用以躲避天敵及不良環(huán)境等(Howardetal.,2001)。椰子織蛾原產(chǎn)于印度、斯里蘭卡(Rao,1922)，現(xiàn)已擴(kuò)散蔓延到泰國(guó)和馬來(lái)西亞等國(guó)，2013年該害蟲入侵我國(guó)海南、廣西等地，在海南省風(fēng)險(xiǎn)值(R)為2.30，屬高度危險(xiǎn)有害生物(閻偉等，2013)。

與椰子織蛾、椰心葉甲外部生態(tài)、生物學(xué)研究相比，兩者腸道內(nèi)容物差異很少被研究。而腸道內(nèi)容物對(duì)昆蟲的生理生化行為具有多種影響，如腸道微生物能夠調(diào)節(jié)寄主的免疫、發(fā)育，改變其食性等(相輝和黃勇平，2008; Ayakoetal.,2015)。同時(shí),椰子織蛾、椰心葉甲相似的生態(tài)位與寄主范圍，可能導(dǎo)致兩者腸道內(nèi)容物具有一定的相似性，使得同時(shí)入侵會(huì)加重危害程度。本文通過(guò)對(duì)椰子織蛾、椰心葉甲腸道樣本進(jìn)行菌群多樣性分析以及腸道代謝通路功能預(yù)測(cè)，以求獲得兩者在腸道微生物、代謝通路之間的異同，探討其對(duì)兩者生態(tài)位分化、入侵機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

在人工氣候箱(A1000, Conviron, Manitoba, Canada)中以恒溫(28±1.0)℃、RH 70%～80%、光周期L∶D=12∶12的條件，在養(yǎng)蟲盒(25 cm×14 cm×7 cm，盒蓋封有48 μm紗網(wǎng))中分別飼養(yǎng)中國(guó)海南省儋州市采集到的椰心葉甲、椰子織蛾。

1.2 樣品處理

將饑餓處理24 h后的3齡椰心葉甲置于冰上3～5 min，待其昏迷。使用70%酒精擦拭昆蟲表面30 s，0.25%次氯酸鈉浸泡1 min，再用無(wú)菌水漂洗3次去除外部污染物。在無(wú)菌環(huán)境下，使用滅菌后的細(xì)尖鉗將昆蟲腹部切開(kāi)，取出整個(gè)腸道，立即用0.9%的無(wú)菌NaCl溶液沖洗2次，然后將內(nèi)容物、中腸和后腸慢慢分離并置于不同的微量離心管(1.5 mL)中。每20頭昆蟲作為一個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，記為1號(hào)樣本。5齡椰子織蛾進(jìn)行相同處理，記為2號(hào)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 主要儀器

超微量分光光度計(jì)NanoDrop2000(Thermo Scientific, USA)，PCR儀GeneAmp?9700型(ABI, USA)，Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina, San Diego, USA)。

1.4 椰心葉甲、椰子織蛾腸道分析

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行每個(gè)樣本總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用通用引物對(duì)可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。以QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件(version 7.1 http:∥drive5.com/uparse/)根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier(http:∥rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。腸道代謝通路豐度使用SAS OnDemand進(jìn)行單因素分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰心葉甲、椰子織蛾腸道微生物豐度差異

椰心葉甲、椰子織蛾腸道微生物相似度較大，其中,分類水平總豐度前10的物質(zhì)分別為藍(lán)菌門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、Saccharibacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、Chlorofiexi、酸桿菌門Acidobacteria(圖1)，其中,酸桿菌門、Saccharibacteria、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)菌門等在2種昆蟲腸道樣本中存在較大豐度差異。

圖1 椰心葉甲與椰子織蛾菌落熱圖

2.2 椰心葉甲、椰子織蛾腸道微生物組間豐度差異顯著性檢驗(yàn)

經(jīng)Wilcox秩和檢驗(yàn)，椰心葉甲、椰子織蛾腸道內(nèi)部分豐度前10的微生物豐度在兩者中存在顯著性差異(圖2)。椰心葉甲腸道中的變形菌門(P=0.012)、Saccharibacteria(P=0.039)等群落豐度顯著高于椰子織蛾；而椰子織蛾腸道中的藍(lán)菌門(P=0.012)、放線菌門(P=0.022)、酸桿菌門(P=0.012)、疣微菌門(P=0.034)等群落豐度顯著高于椰心葉甲。

圖2 椰心葉甲與椰子織蛾菌門Wilcox秩和檢驗(yàn)柱狀圖

2.3 椰心葉甲、椰子織蛾腸道KEGG代謝通路豐度差異分析

對(duì)椰心葉甲、椰子織蛾腸道進(jìn)行分析，并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，可得出兩者腸道代謝通路的差異，椰心葉甲的膦酸酯和亞膦酸鹽代謝(F(1,8)=15.66,P<0.05)、N-聚糖合成(F(1,8)=7.58,P<0.05)等腸道代謝通路顯著強(qiáng)于椰子織蛾，而椰子織蛾的酮體的合成和降解(F(1,8)=8.09,P<0.05)、維生素B6代謝(F(1,8)=8.22,P<0.05)、核黃素代謝(F(1,8)=6.10,P<0.05)、黃酮和黃酮醇生物合成(F(1,8)=8.48,P<0.05)等顯著強(qiáng)于椰心葉甲(表1)。

表1 椰心葉甲、椰子織蛾KEGG腸道代謝通路豐度差異

3 討論

昆蟲腸道中棲息著大量與其存在共生關(guān)系的微生物(郭軍等，2015)，這些微生物與昆蟲的發(fā)育、進(jìn)化等存在密切關(guān)系(姚明燕等，2017；魏曉瑩等，2019)。昆蟲體內(nèi)的腸道共生菌具有提供消化酶、化學(xué)物質(zhì)，改變昆蟲攝取營(yíng)養(yǎng)方式以及效率等重要功能(Akman & Douglas,2009; Mattéottietal.,2012)。通過(guò)16S rRNA菌群預(yù)測(cè)等發(fā)現(xiàn)，危害棕櫚科植物的入侵害蟲椰心葉甲、椰子織蛾在腸道菌群、腸道代謝通路等具有一定相似度與關(guān)聯(lián)性。

椰子織蛾腸道中的藍(lán)菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門等微生物豐度顯著高于椰心葉甲。其中放線菌門由于能產(chǎn)生多種抗生素，而被運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)(阮繼生等，1990; Omura,1999)；疣微菌在實(shí)驗(yàn)室中難以培養(yǎng)，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)具有固氮等少數(shù)作用，但其在系統(tǒng)發(fā)育的獨(dú)特性已被證實(shí)(Dunfieldetal., 2007; John & John,2012)；對(duì)于酸桿菌門，前人發(fā)現(xiàn)酸桿菌門在土壤中具有分解植物殘株中纖維素的功能(Timofeyetal.,2012)。椰子織蛾腸道中顯著較高的酸桿菌門細(xì)菌豐度可能導(dǎo)致其在自然界中能夠適應(yīng)纖維素含量較高的老葉，而椰心葉甲腸道內(nèi)較低的酸桿菌門微生物豐度使其在自然界中偏好取食纖維素含量較低的心葉(Cock & Pacr,1987; Voegele,1989)。二者腸道內(nèi)菌群的差異性可能造成了兩者不同的取食習(xí)慣，而不同的取食習(xí)慣可能誘導(dǎo)了兩者生態(tài)位上不同的分化。

兩者代謝通路方面也存在一定差異，椰子織蛾體內(nèi)酮體的合成和降解、核黃素代謝、維生素B6代謝、黃酮和黃酮醇生物合成等通路豐度顯著高于椰心葉甲，而椰心葉甲的膦酸酯和亞膦酸鹽代謝、N-聚糖合成等腸道代謝通路顯著強(qiáng)于椰子織蛾。酮體代謝在昆蟲體內(nèi)供能等方面具有重要的功能作用。椰子織蛾體內(nèi)較高的酮體代謝功能，有利于其在入侵危害過(guò)程中傳播擴(kuò)散、加快族群建立，這與其成為重要入侵害蟲息息相關(guān)(Hilletal.,1972)。核黃素則被證實(shí)對(duì)于呼吸鏈能量產(chǎn)生等存在關(guān)系(Bruinsetal.,1991)。椰子織蛾體內(nèi)較強(qiáng)的核黃素代謝能力能夠?yàn)槠涮峁└叩暮粑┠?。同時(shí)，在部分昆蟲體內(nèi)已經(jīng)證實(shí)具有參與核黃素合成的共生菌(Minoruetal.,2015; Nakabachietal.,1999)。因此,椰子織蛾腸道內(nèi)較強(qiáng)的核黃素代謝功能可能有其腸道共生菌的參與。而維生素B6對(duì)于昆蟲體內(nèi)多種游離氨基酸的積累具有促進(jìn)作用，在泌絹昆蟲體內(nèi)，缺乏維生素B6能使絲腺發(fā)育停滯(張劍韻和黃龍全，2003)。椰子織蛾作為能夠分泌絲質(zhì)物的昆蟲之一，其體內(nèi)產(chǎn)生的絲質(zhì)物對(duì)于其幼蟲生存、蛹期羽化具有巨大作用。

本文通過(guò)16S rRNA菌群預(yù)測(cè)等分子生物學(xué)方法對(duì)椰子織蛾與椰心葉甲腸道共生菌、代謝通路等進(jìn)行分析，初步探討了兩者腸道菌群、腸道代謝通路等差異對(duì)于兩者生態(tài)位、取食習(xí)慣等可能存在的分化作用，但對(duì)于腸道共生菌中具體作用以及腸道代謝通路具體途徑、相關(guān)酶仍需要進(jìn)一步的探討。今后將繼續(xù)對(duì)椰子織蛾、椰心葉甲腸道代謝通路進(jìn)行具體測(cè)定，同時(shí)部分腸道共生菌已經(jīng)可以進(jìn)行人工篩選以及培養(yǎng)(唐帥等，2016; Fangetal.,2013)，對(duì)于能夠進(jìn)行纖維素分解的共生菌也將繼續(xù)分離，以求取得應(yīng)用上的突破。