TLR4調(diào)控自噬與腎臟疾病的研究進(jìn)展

易揚(yáng)，謝愷慶

據(jù)估計，全世界有8.5 億人因各種原因罹患腎臟疾病，該病作為一個世界性的公共衛(wèi)生問題越來越受到關(guān)注。隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長和生活方式的逐步改變，中國面臨著日益加重的腎臟疾病的負(fù)擔(dān)［1］。有研究表明，炎癥在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，腎臟固有細(xì)胞急性損傷后所誘發(fā)的炎癥瀑布是急性腎損傷加重的主要原因，而腎臟細(xì)胞慢性損傷所觸發(fā)的慢性炎癥導(dǎo)致腎間質(zhì)過度纖維化是腎功能進(jìn)行性惡化的主要原因［2］。Toll 樣受體 4（Tolllike receptor 4，TLR4）被內(nèi)源性或者外源性配體激活后可誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，同時也可引起胞漿微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）的聚集（自噬體形成的標(biāo)志）；TLR4 激活自噬受髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）或含 TIR 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)接蛋白（TIR-domain-containing adaptor protein including IFN-β，TRIF）與 Beclin1（自噬早期標(biāo)志物）相互作用所調(diào)控［3-4］。有研究顯示，TLR4 調(diào)控的自噬參與包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致腎損傷、腎缺血性再灌注損傷、糖尿病腎病、順鉑所致腎損傷、乙肝所致腎損傷等多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展［5-6］。因此深入探索腎臟疾病的自噬調(diào)控機(jī)制，尋找治療或者延緩腎臟疾病進(jìn)展的方法具有重要意義。本文將從TLR4 介導(dǎo)自噬異常與腎臟疾病的研究進(jìn)展做一綜述。

1 自噬

自噬現(xiàn)象是20 世紀(jì)60 年代科學(xué)家Ashford 和Porter 用電子顯微鏡在人的肝細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)［7］。自噬及自噬異常相關(guān)疾病的機(jī)制是目前醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。自噬與神經(jīng)退行性疾病、癌癥、感染和炎性腸病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［8-10］。自噬主要分為起始、囊泡成核、延伸和融合3 個階段。自噬的起始ULK1/ATG1 復(fù)合物（自噬啟動復(fù)合物），其哺乳動物同源蛋白命名為ULK1，在酵母中命名為自噬相關(guān)基因1（ATG1）。ATG6（哺乳動物同源蛋白命名為Beclin1）的復(fù)合物是細(xì)胞自噬過程中最重要的正性調(diào)節(jié)因子，也是自噬小泡成核所必需的，Beclin1及其上下游信號調(diào)節(jié)蛋白組成重要的自噬調(diào)節(jié)通路。Beclin1 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬主要通過BH3 結(jié)構(gòu)域與Bcl-2 基因的相互作用來實(shí)現(xiàn)。在自噬小泡核化的初級階段激活Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）需要依賴于多蛋白復(fù)合物的形成；在成核后吞噬受損的細(xì)胞器與大分子物質(zhì)形成自噬體，稱為自噬小體（autophagosome），完整的自噬小體沿著微管轉(zhuǎn)運(yùn)，將其內(nèi)容物傳遞到溶酶體內(nèi)降解形成自噬溶酶體。隨后，溶酶體酶降解自噬體的內(nèi)容物可以用于合成新的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器及能量。

2 TLR4信號通路

TLR4 是最早被發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞表面的TLRs蛋白，1997 年被 Medzhitov 等［11］首次發(fā)現(xiàn)，在先天性免疫應(yīng)答中扮演著不可或缺的角色。TLR4 可特異性識別來源于細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原相關(guān)分子模式（PAMPs），也可識別來源于腫瘤、壞死或凋亡的細(xì)胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），并與之結(jié)合，進(jìn)而激活TLR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)相關(guān)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。TLR4 和骨髓分化因子2 作為共同受體來識別其配體，并與配體相結(jié)合后激活 TLR4/CD14/MD2 復(fù)合物，活化的TLR4 胞內(nèi)TLR 樣結(jié)構(gòu)域與MyD88 的羧基端結(jié)合，繼而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），然后在早期激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB），促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生；或者TLR4 通過 TRIF/TICAM-1 和 TRIF/TICAM-2 激活晚期的NF-κB，同時激活TRIF-TBK/IRF3 信號通路引起Ⅰ型干擾素的釋放，以及誘發(fā)免疫系統(tǒng)的調(diào)控性應(yīng)答［12-13］。TLR4 既可以激活依賴性 MyD88 信號通路，也可激活TRIF 信號通路，依賴/非依賴性途徑最終均可活化NF-κB 和MAPK 信號通路，誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抗病毒及抗細(xì)菌免疫。

3 TLR4信號通路調(diào)控自噬

3.1 TLR4 調(diào)控自噬 早期研究將自噬與天然免疫聯(lián)系起來，認(rèn)為這是宿主對多種細(xì)胞內(nèi)病原體的防御反應(yīng)［14］。在感染過程中自噬的調(diào)控過程是復(fù)雜的，由許多受體介導(dǎo)，TLR4 可識別病原體的特定分子模式，在天然免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要作用，是第1 個被證明參與自噬過程的受體。自噬是一種細(xì)胞對饑餓的反應(yīng)，可以將受損的細(xì)胞器和長壽的蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)送到溶酶體來清除。然而，多種免疫和炎癥信號通過TLR4 介導(dǎo)自噬異常［15］，若誘發(fā)自噬增強(qiáng)不足或被抑制則引起宿主細(xì)胞自我保護(hù)作用削弱，致細(xì)胞受損及觸發(fā)炎癥反應(yīng)；若誘發(fā)自噬過度增強(qiáng)則觸發(fā)宿主細(xì)胞凋亡。有研究表明TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的同時也誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬小體形成明顯增多［16-17］。

3.2 TLR4-MyD88 的信號通路調(diào)控自噬 TLR4 下游通路蛋白 MyD88 直接或間接將Beclin1 引入TLR4 信號復(fù)合物中，可減少Beclin1 和Bcl-2 之間的相互作用，誘導(dǎo)Beclin1 的泛素化，導(dǎo)致Bcl-2 釋放Beclin1 啟動自噬體的形成。TRAF6 可激活NF-κB 從而誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，是TLR4-MyD88 信號通路中的關(guān)鍵分子。通過招募Beclin1 并誘導(dǎo)Beclin1 的泛素化后可激活自噬。磷酸化的UNC-51樣激酶 1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）一直以來被認(rèn)為是自噬的一個關(guān)鍵調(diào)控因子，自噬溶酶體組裝前，自噬信號是通過由 mAtg13、FIP200（酵母中Atg17 的同系物）、ULK1（酵母中 Atg1 的同系物）3種蛋白形成的ULK1 復(fù)合物的活化介導(dǎo)的。在體內(nèi)ULK1 復(fù)合物是連接上游營養(yǎng)或能量感受器雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）與下游自噬體形成的橋梁，泛素化TRAF6也可激活ULK1 而促進(jìn)自噬。近期研究表明，在七氟醚治療老年大鼠模型中，雷帕霉素可通過TLR4-MyD88 信號通路減輕腦組織損傷和激活自噬的產(chǎn)生［18］。

3.3 TLR4-TRIF 信號通路調(diào)控自噬 細(xì)菌感染會引發(fā)自噬和炎癥的激活，相關(guān)研究已經(jīng)證明，銅綠假單胞菌感染可通過TLR4-TRIF 信號通路激活自噬［19］。朊病毒病是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是朊蛋白的錯誤折疊、腦內(nèi)海綿狀改變以及小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛激活引起的腦炎癥。NALP3 炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，是先天免疫系統(tǒng)的組成部分，可以調(diào)控細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子。Lai 等［20］在首次探討朊病毒病中炎癥與自噬的相互調(diào)節(jié)作用時，發(fā)現(xiàn)自噬可抑制經(jīng)朊蛋白片段106-126（PrP106-126）處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中NALP3 炎癥小體的激活，同時也抑制隨后的 caspase-1 裂解和白細(xì)胞介素（IL）-1β 的釋放，而NALP3 炎癥小體通過激活caspase-1 裂解TRIF 限制自噬。TLR4 或 TRIF 基因敲除抑制PrP106-126 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的自噬，提示TLR4-TRIF 信號通路參與PrP106-126 誘導(dǎo)的自噬。自噬和炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后繼發(fā)性腦損傷中起著重要作用。在大鼠TBI 模型中，TAK-242 可顯著降低 TBI 誘導(dǎo) TLR4、Beclin1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，并維持24 h 內(nèi)P62 表達(dá)水平無明顯變化。通過蛋白質(zhì)印跡分析表示，TLR4 下游信號分子 TRIF、NF-κB、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和IL-1β 在海馬組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。有研究表明，TLR4/TRIF 信號通路可參與調(diào)控海馬神經(jīng)元自噬［3］。Gao 等［21］研究發(fā)現(xiàn) TLR3 基因的敲除可通過TLR3-TRIF 抑制自噬，減輕小鼠心肌梗死面積，減輕心力衰竭并改善生存率［21］。

3.4 NF-κB 調(diào)控自噬 NF-κB 被認(rèn)為是調(diào)控炎癥相關(guān)基因誘導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和凋亡等多種細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用。在人類中，至少有5 名NF-κB 家族成員，包括 NF-κB2（P52）、NF-κB1（P50）、RelB（relb 原癌基因，NF-κB 亞基）、c-rel（relto-原癌基因，NF-κB亞基）和 rela（rela-原癌基因，NF-κB 亞基，P65）［22］。NF-κB 介導(dǎo)的炎癥與自噬之間相互作用、相互依賴［23-24］。NF-κB 活化可以抑制細(xì)胞自噬水平。TRAF6 作為NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，可被TLR4 激活而產(chǎn)生，也可誘導(dǎo)自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1 泛素化。然而，Beclin1 泛素化被一種NF-κB 抑制劑 A20 所抑制，導(dǎo)致自噬被抑制［25］。腫瘤壞死因子激活的NF-κB 通過激活mTOR 和抑制活性氧的積累，從而抑制自噬的發(fā)生［26］。然而，在另一些情況下，NF-κB 活性又可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平。在熱休克后的恢復(fù)期內(nèi)，NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子被激活，可以通過調(diào)節(jié)自噬體的成熟誘導(dǎo)自噬，對熱休克后的細(xì)胞存活有至關(guān)重要的作用。NF-κB 與Beclin1基因啟動子上的NF-κB 的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而激活自噬的產(chǎn)生［23］。

4 TLR4調(diào)控自噬與腎臟疾病的關(guān)系

4.1 LPS 所致腎損傷 膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷（acutekidney injury，AKI）最常見的致病因素是膿毒癥。在成人和兒童的研究數(shù)據(jù)中，膿毒癥占發(fā)達(dá)國家所有AKI 的26%～50%，而在原發(fā)性腎臟疾病相關(guān)的 AKI 中占 7%～10%［27］。LPS 是革蘭陰性膿毒癥時釋放的一種免疫原性細(xì)菌細(xì)胞壁成分，TLR4 是LPS 的主要受體。Leventhal 等［28］通過腹腔注射 LPS建立化膿性AKI 小鼠模型，結(jié)果顯示，TLR4 基因缺失的 C57BL/10SCN 小鼠注射 LPS（15 mg/kg）24 h后，腎皮質(zhì)LC3-Ⅱ積累與對照組（注射生理鹽水）無明顯差異。分離原代腎皮質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞，并將其在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)一步證實(shí)TLR4 在LPS 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬的作用。該研究表明，LPS 不能誘導(dǎo)來自C57BL/10SCN 小鼠的腎小管上皮細(xì)胞自噬；首次證明LPS 是依賴于TLR4 信號通路誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的自噬。該研究還采用腎小管特異性自噬蛋白7（ATG7）基因缺失的小鼠模型，確定了自噬對LPS 誘導(dǎo)的AKI 的腎小管具有保護(hù)作用，從而確定自噬是防治膿毒性AKI 的新靶點(diǎn)。Zhao 等［29］研究顯示，LPS 可通過TLR4-MyD88 途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表達(dá)上調(diào)；同時顯著提高 LC3B和Beclin1 的表達(dá)水平；且研究表明熊果酸（UA）可通過TLR4/MyD88 途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自噬從而預(yù)防LPS 導(dǎo)致的腎損傷。

4.2 腎缺血再灌注損傷 缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是造成 AKI 第二大原因，常見于各種原因?qū)е碌氖а⑿菘?、器官移植等過程中。IRI 所致的腎損傷能夠造成組織器官發(fā)生不可逆的損傷，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥和腎小管細(xì)胞損傷［30］。TLR4 在腎臟組織中高表達(dá)，并且還可通過TLR4-MyD88 信號通路參與腎IRI 的過程［31］。Poluzzi 等［32］研究顯示，腎 IRI 小鼠在 IRI發(fā)作時，TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬細(xì)胞中Biglycan（富含小亮氨酸的雙糖鏈蛋白聚糖）所誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ、P62 表達(dá)水平被顯著抑制。共聚焦顯微鏡下可見TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬細(xì)胞中自噬水平降低。此研究結(jié)果提示Biglycan 可通過TLR4 與CD44 相互作用激活巨噬細(xì)胞中的自噬，從而減少腎臟炎癥及損傷。因此TLR4 調(diào)控自噬在缺血再灌注所導(dǎo)致的AKI 中具有重要作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

4.3 糖尿病腎病 糖尿病腎病是糖尿病全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，也是糖尿病最常見且最影響其預(yù)后的慢性并發(fā)癥［33］。研究已證實(shí)，糖尿病最終發(fā)展為終末期腎衰竭的主要原因之一是由糖尿病引起的慢性炎癥反應(yīng)，而TLR4 激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與這種炎癥反應(yīng)有關(guān)［34］。Xu 等［35］在體外采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理腎小管上皮細(xì)胞模型，抑制TLR4 表達(dá)后LC3-Ⅱ表達(dá)水平降低，P62 表達(dá)水平增高。研究結(jié)果提示TLR4 可參與調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的自噬。Wang 等［36］研究表明，在糖尿病患者腎組織足細(xì)胞內(nèi)基因敲除MyD88 后可下調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)，但上調(diào)P62 和p-mTOR 的表達(dá)，然而敲除TRIF 基因?qū)@些蛋白質(zhì)的表達(dá)無明顯影響。研究結(jié)果提示TLR4-MyD88 信號通路參與誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬。足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病中腎小球硬化和蛋白尿的主要發(fā)病機(jī)制。足細(xì)胞的基底自噬率在所有腎細(xì)胞中最高，因此這種自身修復(fù)機(jī)制對足細(xì)胞來說尤其重要［37］。

4.4 順鉑所致腎損傷模型 順鉑具有明顯的腎毒性，是一種常用的化療藥。大量研究已經(jīng)證實(shí)，順鉑可激活腎小管上皮細(xì)胞自噬［38-39］。腎小管上皮是腎損傷的重要靶點(diǎn)，并且對腎毒素和缺血再灌注引起的腎損傷更敏感，更易激活自噬。相關(guān)研究表明，TLR4 在順鉑所致腎損傷進(jìn)展中起著不同的作用。TLR2 和TLR4 在腎臟組織中高度表達(dá)，并參與順鉑誘導(dǎo)的 AKI［40］。Shen 等［41］采用順鉑誘導(dǎo)腎損傷小鼠模型，研究結(jié)果表明TLR2 可促進(jìn)PI3K/Akt 磷酸化，增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞的自噬，對順鉑誘導(dǎo)的AKI具有保護(hù)作用，而TLR4 在順鉑所致腎損傷進(jìn)展中起著不同的作用。Andrade-Silva 等［6］采用腹膜內(nèi)注射順鉑誘導(dǎo)的AKI 小鼠模型，將其分為順鉑組、順鉑+TLR4KO（TLR4 的基因敲除）組、順鉑+TLR2KO（TLR2 的基因敲除）組，順鉑+TLR2KO 組小鼠的自噬相關(guān)分子（即LC3 和ATG5）表達(dá)水平低于順鉑+TLR4KO 組；與順鉑組相比，缺乏TLR2 會導(dǎo)致嚴(yán)重的腎組織損傷，而缺乏TLR4 可防止小鼠腎組織的損傷；研究結(jié)果提示TLR4 可通過依賴性MyD88 信號通路及TRIF 信號通路激活自噬；因此在腎損傷時TLR4 可通過TRIF 信號通路產(chǎn)生不同于TLR2激活自噬時的反應(yīng)。

4.5 乙肝所致腎損傷 我國是乙型肝炎大國，AKI是終末期肝病最常見的并發(fā)癥之一［42］。張曉田等［43］研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）感染致腎損傷中也有自噬信號異常激活，采用HBV 感染患者的血清感染人腎小管上皮細(xì)胞系，并進(jìn)行體外培養(yǎng)和TLR4 靶向干預(yù)實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)HBV 感染組的LC3-B 和Beclin1 表達(dá)水平升高，P62 表達(dá)水平降低，提示HBV 感染可激活腎小管上皮細(xì)胞的自噬，這可能是一種自我保護(hù)機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR4/NF-κB 信號通路后自噬水平加強(qiáng)，而抑制TLR4/NF-κB 信號通路后自噬水平有所減弱，證明通過靶向干預(yù)TLR4 能夠調(diào)控HBV 感染腎小管上皮細(xì)胞的自噬。

5 結(jié)論與展望

自噬是真核細(xì)胞中高度保守的細(xì)胞生理性活動過程，在生理情況下，自噬參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，廣泛參與到多種細(xì)胞重要生理過程的調(diào)控。腎損傷時，自噬可吞噬破裂的溶酶體以及恢復(fù)溶酶體功能，以防止細(xì)胞損傷；還可通過抑制炎癥小體的活性，同時清除受損細(xì)胞器并對炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以防炎性因子的產(chǎn)生。近年來TLR4 調(diào)控自噬與腎臟疾病中的作用已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān)注，但目前其具體機(jī)制尚無定論。在不同原因?qū)е碌募甭阅I損傷中均有研究報道顯示TLR4 激活自噬對腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用；然而在順鉑導(dǎo)致腎損傷模型中，TLR4 可介導(dǎo)自噬異常從而加劇腎小管損傷并對腎臟功能造成影響。目前在腎臟疾病中TLR4 調(diào)控自噬雙重作用尚未完全闡明，涉及的具體信號通路調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索。闡明在腎臟疾病中TLR4 調(diào)控自噬的發(fā)生機(jī)制和作用，并加以合理的干預(yù)和利用，開發(fā)調(diào)控自噬的藥物，可為臨床尋找延緩或防治腎臟疾病提供精確的治療靶點(diǎn)。