RyhB-cysE基因?qū)η葜虏⌒源竽c桿菌生物表型的影響

涂健 阮苑 蔡偉真 宋祥軍 邵穎 祁克宗

摘要：在禽致病性大腸桿菌（APEC）AE17及AE17△RyhB的基礎(chǔ)上利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE， 對(duì)野生株和基因缺失株的生長(zhǎng)、生物被膜形成和運(yùn)動(dòng)特性進(jìn)行分析，并采用qRT-PCR技術(shù)比較野生株和缺失株中與運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，各菌株生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著差異;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力較AE17顯著下降;AE17△cysE 、AE17△RyhB△cysE運(yùn)動(dòng)能力與AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE與AE17相比f(wàn)lhB 、flgD、fliF和 cheY轉(zhuǎn)錄水平均降低，而AE17△RyhB△cysE與AE17△cysE相比基因轉(zhuǎn)錄水平均有所增強(qiáng);AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE與AE17相比，flhD 、flgC、sidA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及運(yùn)動(dòng)能力，且RyhB基因缺失對(duì)cysE基因的運(yùn)動(dòng)能力調(diào)控作用有代償作用，RyhB、cysE基因均通過(guò)調(diào)節(jié)與生物被膜形成相關(guān)的基因（flhD 、flgC、sidA）轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控APEC生物被膜形成能力，本研究結(jié)果為研究RyhB-cysE基因?qū)PEC的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌;RyhB基因;cysE基因;生物被膜;運(yùn)動(dòng)性

中圖分類號(hào)：S851.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）05-1247-08

Abstract：Based on avian pathogenic Escherichia coli （APEC） AE17 and AE17△RyhB， gene-deleted strains AE17△cysE and AE17△RyhB△cysE were constructed using Red homologous recombination technology. The growth， biofilm formation and motion characteristics of wild and gene-deleted strains were analyzeds and qRT-PCR technology was used to compare the transcription levels of genes related to motility and biofilm formation in wild and gene-deleted strains. The results showed that there was no significant difference in the growth curve of each strain. The biofilm formation ability of AE17△RyhB， AE17△cysE， AE17△RyhB△cysE was significantly lower than that of AE17. Compared with AE17， the transcription levels of flhB， flgD， fliF and cheY in AE17△cysE and AE17△RyhB△cysE were reduced， while AE17△RyhB△cysE had enhanced gene transcription levels compared with AE17△cysE. The AE17△RyhB， AE17△cysE， AE17△RyhB△cysE and AE17 flhD， flgC and sidA were significantly reduced. The results indicated that the deletion of cysE gene reduced the ability of APEC biofilm formation and exercise， and RyhB gene had a compensatory effect on the regulation of cysE gene's exercise capacity. RyhB and cysE genes regulated the biofilm formation ability of APEC by regulating transcription level of genes（flhD， flgC and sidA） related to biofilm formation. These results of this study lay a foundation for studying the regulatory effect of RyhB-cysE gene on APEC.

Key words：avian pathogenic Escherichia coli;RyhB gene;cysE gene;biofilm;motility

禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichiacoli，APEC）是腸外致病性大腸桿菌，可以導(dǎo)致禽類出現(xiàn)全身性感染，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)禽業(yè)。同時(shí)APEC 可以通過(guò)食源性途徑傳播給人類，是人源腸外致病性大腸桿菌毒力基因的潛在貯存宿主。加強(qiáng)對(duì)APEC研究，不僅有助于養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，也具有較大的公共衛(wèi)生學(xué)意義[1]。在大腸桿菌研究中，已經(jīng)證明小分子RNA參與了諸多生命過(guò)程，其中包括轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、鐵代謝途徑、糖代謝途徑、膜蛋白生物合成、群體感應(yīng)系統(tǒng)以及致病菌的致病力調(diào)節(jié)等。而RyhB作為小分子RNA，是目前已知調(diào)控的靶mRNA數(shù)目最多，其作為關(guān)鍵組成部分參與大腸桿菌諸多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)菌的致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。本試驗(yàn)前期已構(gòu)建AE17 △RyhB并進(jìn)行Label-free蛋白組學(xué)測(cè)序及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出RyhB基因與RNA 伴侶 Hfq共同靶基因cysE[2]。

CysE（Serine acetyltransferase）蛋白屬于轉(zhuǎn)移酶家族的酰基轉(zhuǎn)移酶，在微生物中參與合成半胱氨酸。在代謝調(diào)控系統(tǒng)中，半胱氨酸主要參與抵制細(xì)胞代謝中硫化物的進(jìn)入，同時(shí)半胱氨酸是一些生物元件合成途徑所必需的元素，例如甲硫氨酸、一些維生素和金屬簇等均由半胱氨酸參與合成。這個(gè)蛋白質(zhì)不僅參與半胱氨酸合成反應(yīng)，同時(shí)也參與蛋氨酸代謝、硫代謝等[3]，對(duì)微生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。

本研究利用 Red 重組技術(shù)在AE17、 AE17△RyhB的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE，并比較它們的生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力等生物學(xué)特性差異，并采用qRT-PCR技術(shù)比較野生株和缺失株中與運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，為研究RyhB-cysE基因?qū)PEC的調(diào)控作用以及揭示APEC的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料

1.1.1菌種、質(zhì)粒及試劑APEC AE17，為本實(shí)驗(yàn)室保存的O2血清型臨床分離株;AE17△RyhB由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[4]。Red同源重組輔助質(zhì)粒：pKD46（氨芐青霉素抗性）、pKD3（攜帶可被FLP重組酶識(shí)別的FRT位點(diǎn)，氯霉素抗性）、pCP20（42 ℃可表達(dá)FLP重組酶，用于消除FLP位點(diǎn)間的氯霉素抗性基因）均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。氯霉素、氨芐青霉素、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、瓊脂糖、質(zhì)粒小量提取純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù) GenBan登錄的APEC cysE基因序列（ID：4493517），分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增cysE基因上游、下游序列2對(duì)引物cysE-U-F/cysE-U-R和cysE-D-F/cysE-D-R。用于擴(kuò)增抗性基因的引物：cysE-cm-F/cysE-cm-R;設(shè)計(jì)的用于鑒定RyhB、cysE基因缺失株的2對(duì)引物：cysE-IN-F/cysE-IN-R、cysE-OUT-F/cysE-OUT-R、RyhB-IN-F/RyhB-IN-R、RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R。以上引物（表1）均由合肥通用生物科技有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE構(gòu)建與鑒定以AE17、AE17△RyhB為親本株，使用改良的Red重組方法[5-6]構(gòu)建cysE基因缺失菌株。以提取的AE17、AE17△RyhB基因組為模板，分別使用引物cysE-U-F/cysE-U-R和cysE-D-F/cysE-D-R，通過(guò)PCR擴(kuò)增cysE基因的上游和下游片段。以pKD3為模板，用引物cysE-cm-F/cysE-cm-R通過(guò)PCR擴(kuò)增氯霉素抗性（Cm+）片段。以上述純化的PCR產(chǎn)物為模板，以cysE-U-F/cysE-D-R為引物，采用Overlap-PCR技術(shù)，PCR擴(kuò)增用于cysE基因缺失的打靶片段。將構(gòu)建的打靶片段電轉(zhuǎn)化至含有pKD46質(zhì)粒的AE17、AE17△RyhB感受態(tài)細(xì)胞中，重組細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)1 h后涂布于含有30 μg/ml Cm+的LB平板上，孵育24 h后，挑取單克隆，用cysE-IN-F/cysE-IN-R、cysE-OUT-F/cysE-OUT-R引物PCR鑒定cysE基因缺失株，利用pCP20質(zhì)粒將cysE基因缺失株氯霉素抗性消除并測(cè)序，鑒定成功的陽(yáng)性重組子菌株為AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE。

1.2.2各菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定將AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE 4 株菌分別接種到LB平板，從平板上挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)其600 nm吸光度OD600值，根據(jù)OD600值繪制上述菌株的生長(zhǎng)曲線。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3各菌株生物被膜形成能力測(cè)定將AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE菌株分別培養(yǎng)至OD600=1.0，用LB液體按照1∶50（體積比）稀釋菌液，加入到96孔聚丙烯板中，每孔200 μl，以無(wú)菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)48 h，每孔加入200 μl PBS洗滌3遍，晾干后每孔加入200 μl 0.1%結(jié)晶紫溶液，37 ℃染色20 min，PBS 洗滌3遍，晾干，每孔加入200 μl 33%乙酸，充分溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔樣本620 nm處的吸光度 OD620值，并通過(guò) GraphPad Prism 6 paired t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。

1.2.4掃描電鏡觀察各菌株生物被膜在6孔細(xì)胞板中放入細(xì)胞爬片，分別加入2 ml含量為108CFU/ml的AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE菌液，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)的細(xì)胞爬片取出，PBS清洗3遍，晾干，細(xì)胞爬片經(jīng)過(guò)固定、脫水、干燥、黏臺(tái)、噴金處理后用掃描電鏡觀察。

1.2.5各菌株運(yùn)動(dòng)性測(cè)定將AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE菌株分別培養(yǎng)至OD600=1.0，4 000 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整OD600=2.0，配制新鮮運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（每100 ml含有1.00 g蛋白胨、0.50 g氯化鈉、0.80 g葡萄糖、0.25 g瓊脂粉），待冷卻后在板的中央加入2 μl菌體，置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6～8 h，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)情況并測(cè)量菌圈大小。

1.2.6透射電鏡觀察各菌株鞭毛形態(tài)將上述4株菌分別培養(yǎng)至OD600=1.0，2 000 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS緩沖液洗3次，最后用PBS重懸，吸取200 μl重懸液經(jīng)負(fù)染處理后用透射電鏡觀察。

1.2.7各菌株運(yùn)動(dòng)性、生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7]，選取與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物被膜相關(guān)基因 fliY、 flhB、flgD、fliF、fliM、 cheY、 flhD、 flhC、sidA，16S作為內(nèi)參基因，分別設(shè)計(jì)引物（表2），進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)缺失株與野生株基因的轉(zhuǎn)錄水平差異。參照文獻(xiàn)[8]的方法，將上述4株菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中前期，各取1 ml 菌液提取mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以相應(yīng)的cDNA為模板。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct （Livak）法分析并計(jì)算各目的基因轉(zhuǎn)錄水平[9]。

2結(jié)果與分析

2.1AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE的鑒定

采用Red同源重組的方法構(gòu)建cysE基因缺失株，通過(guò)特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。以cysE-IN-F/cysE-IN-R為引物，AE17、AE17△RyhB擴(kuò)增出625 bp的cysE基因片段，cysE基因缺失株（AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE）擴(kuò)增不出目的片段（圖 1）。以cysE-OUT-F/cysE-OUT-R為引物，AE17、AE17△RyhB擴(kuò)增出1 992 bp目的片段，AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE擴(kuò)增出1 303 bp目的片段（圖 1），測(cè)序結(jié)果表明AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE構(gòu)建成功。

2.2各菌株的生長(zhǎng)曲線

各菌株生長(zhǎng)曲線顯示，AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE均經(jīng)歷0～3 h 的延滯期，在第3 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期。4株菌株在2 h之前沒有明顯區(qū)別;在2～3 h，AE17△RyhB、AE17△RyhB△cysE與AE17相比沒有明顯區(qū)別，AE17△cysE與AE17相比生長(zhǎng)緩慢;在3～12 h，AE17△RyhB與AE17相比沒有明顯變化，AE17△cysE與AE17相比生長(zhǎng)緩慢，AE17△RyhB△cysE與AE17相比在9 h后生長(zhǎng)緩慢;在13～16 h 4株菌株之間無(wú)明顯區(qū)別（圖2）。表明RyhB基因缺失對(duì)APEC的生長(zhǎng)速度無(wú)影響，cysE基因缺失APEC的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速度有所降低，RyhB、cysE基因共同缺失對(duì)APEC的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著影響。

2.3各菌株生物被膜的形成能力

用改良結(jié)晶紫半定量法檢測(cè)AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力，結(jié)果顯示AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力極顯著低于AE17（P<0.01），表明 RyhB、cysE基因缺失APEC生物被膜形成能力下降（圖3）。

掃描電鏡觀察各菌株生物被膜，結(jié)果顯示，AE17在堆狀的微菌落中，菌與菌之間絲狀物較多，而AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE菌與菌之間絲狀物較少;4株菌株的生物被膜的片狀結(jié)構(gòu)均不明顯，但AE17依稀可見有大片片狀結(jié)構(gòu)，而AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE幾乎看不到片狀結(jié)構(gòu)的存在（圖4）。表明 RyhB、cysE基因缺失APEC導(dǎo)致生物被膜形成能力下降。

2.4各菌株的運(yùn)動(dòng)能力

各菌株運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定結(jié)果顯示：AE17△RyhB運(yùn)動(dòng)圈直徑與AE17相比無(wú)明顯差異，AE17△cysE運(yùn)動(dòng)圈直徑極顯著小于AE17（P<0.01），AE17△RyhB△cysE運(yùn)動(dòng)圈直徑顯著小于AE17（P<0.05），但比AE17△cysE大（圖5）。表明cysE基因缺失降低了APEC運(yùn)動(dòng)能力，RyhB基因缺失對(duì)cysE基因運(yùn)動(dòng)能力調(diào)控有代償作用。

透視電鏡觀察各細(xì)菌鞭毛數(shù)，結(jié)果顯示，AE17△cysE鞭毛數(shù)與AE17相比顯著減少，AE17△RyhB、AE17△RyhB△cysE鞭毛數(shù)與AE17相比有所減少，但比AE17△cysE多（圖6）。表明RyhB、cysE基因缺失APEC鞭毛數(shù)均有所下降，但cysE基因?qū)PEC鞭毛數(shù)的影響大于RyhB基因，且RyhB基因缺失對(duì)cysE基因的鞭毛調(diào)節(jié)作用有代償作用。

2.5各菌株運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

采用qRT-PCR對(duì)AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE 運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，結(jié)果顯示，AE17△cysE較AE17 fliY、 flhB 、flgD、fliF、fliM和 cheY基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降，AE17△RyhB較AE17 flhB、fliF、fliY、fliD、cheY基因轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢(shì)，而fliM基因轉(zhuǎn)錄水平有上調(diào)趨勢(shì);AE17△RyhB△cysE與AE17相比，其flhB 、flgD、fliF和 cheY基因轉(zhuǎn)錄水平均下降，但與AE17△cysE相比均有所增強(qiáng)（圖7）。表明cysE基因缺失APEC運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下降，且RyhB基因缺失對(duì)cysE基因的轉(zhuǎn)錄水平有代償作用。AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE 生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示，AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE與AE17相比，flhD 、flhC、sidA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，且轉(zhuǎn)錄水平降低幅度相近，表明RyhB、cysE基因均通過(guò)調(diào)節(jié)與生物被膜形成的相關(guān)基因flhD 、flhC、sidA轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控APEC生物被膜形成能力。

3討論

大腸桿菌是人及動(dòng)物腸道的常在菌群，但是致病性大腸桿菌卻可以引起人及動(dòng)物諸多疾病[10-12]。病原菌的致病過(guò)程體現(xiàn)在病原和宿主細(xì)胞相互作用的過(guò)程，對(duì)病原來(lái)說(shuō)要經(jīng)歷黏附、侵入、生長(zhǎng)繁殖、抵抗宿主免疫反應(yīng)、產(chǎn)生毒素等過(guò)程，大腸桿菌亦是如此。細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)被認(rèn)為是一種細(xì)菌適應(yīng)不良環(huán)境而形成的保護(hù)模式，與浮游細(xì)胞相比，生活在生物被膜內(nèi)的細(xì)菌抵抗抗生素和免疫系統(tǒng)的能力更強(qiáng)[13-14]。生物被膜通過(guò)增強(qiáng)細(xì)菌抗宿主免疫系統(tǒng)和提高在環(huán)境中的生存能力，進(jìn)而能增強(qiáng)細(xì)菌的致病性[15]。細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性和黏附性在細(xì)菌致病性中發(fā)揮重要作用[16]。研究RyhB、cysE基因?qū)η葜虏⌒源竽c桿菌的生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)性影響，可為揭示其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

RyhB基因缺失株AE17△RyhB與野生菌株AE17相比生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯變化，但cysE基因缺失APEC的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速度有所降低，而cysE、RyhB基因共同缺失時(shí)對(duì)APEC的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著影響，僅在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期生長(zhǎng)速率稍微緩慢。cysE基因單缺失時(shí)會(huì)影響APEC生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率，猜測(cè)是由于基因影響細(xì)菌的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生的，而cysE、RyhB基因共同缺失時(shí)無(wú)顯著影響，僅在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期生長(zhǎng)速率較慢，猜測(cè)是RyhB基因缺失對(duì)cysE基因調(diào)控的細(xì)菌代謝作用具有補(bǔ)償機(jī)制且該機(jī)制具有時(shí)效性，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

用改良結(jié)晶紫半定量法檢測(cè)AE17、AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力，結(jié)果顯示，AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力極顯著低于AE17，且AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力相似。qRT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE與AE17 flhD 、flhC、sidA均顯著降低，且轉(zhuǎn)錄水平降低幅度相近。推測(cè)RyhB基因通過(guò)cysE基因調(diào)控APEC fhlD 、flhC、sidA基因的生物被膜形成能力，APEC cysE基因是RyhB基因調(diào)控生物被膜形成能力的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。flhD 、flhC、sidA均為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄雙重調(diào)節(jié)因子，推測(cè)其結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控細(xì)菌的生物被膜形成能力。flhD 、flhC的突變可對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生促進(jìn)或抑制的影響，具體取決于突變位點(diǎn)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失cysE、RyhB基因的APEC菌株中的flhD 、flhC基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，說(shuō)明APEC cysE、RyhB基因缺失菌株通過(guò)調(diào)節(jié)fhlD 、flhC基因轉(zhuǎn)錄水平從而抑制生物被膜的形成。研究結(jié)果表明，在腸致病性大腸桿菌中缺失 sdiA后，其生物被膜形成和運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因（如纖維素合成亞基 bcsA基因、鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白fliC基因及Curlin菌毛合成亞基 csgA基因）轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，生物被膜的形成及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，說(shuō)明sdiA對(duì)細(xì)菌的生物被膜形成具有負(fù)調(diào)控作用[18]。本試驗(yàn)APEC缺失cysE、RyhB基因后sdiA基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，可能通過(guò)抑制生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而降低其生物被膜的形成。具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

運(yùn)動(dòng)性能力測(cè)定以及透射電鏡觀察細(xì)菌鞭毛結(jié)果顯示，cysE基因缺失APEC運(yùn)動(dòng)性顯著下降;RyhB基因缺失APEC運(yùn)動(dòng)性無(wú)顯著變化;RyhB、cysE雙基因缺失APEC運(yùn)動(dòng)性較cysE基因缺失APEC運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，與野生菌株相比降低。qRT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，cysE基因缺失株與AE17相比，APEC運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因 fliY、 flhB 、flgD、fliF、fliM和cheY轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降;但AE17△RyhB△cysE flhB、flgD、fliF、fliM和cheY基因的轉(zhuǎn)錄水平較AE17△cysE均有所增強(qiáng)，flhB是鞭毛生物合成蛋白質(zhì)[19]，是Ⅲ型分泌系統(tǒng)中與鞭毛蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白質(zhì);cheY是擴(kuò)散性反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，可以被cheA磷酸化，能改變鞭毛的運(yùn)動(dòng)方向[20];fliY 是細(xì)菌鞭毛馬達(dá)開關(guān)蛋白質(zhì)，在病原菌侵襲相關(guān)鞭毛運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21];fliF是鞭毛基體的MS環(huán)的主要成分，將鞭毛固定在細(xì)胞質(zhì)膜上;flgD與fliM構(gòu)成鞭毛基體的C環(huán)，參與改變鞭毛旋轉(zhuǎn)方向[22]。推測(cè)cysE基因缺失通過(guò)下調(diào)flgD、fliF、flhB、cheY、 fliM基因轉(zhuǎn)錄水平控制鞭毛的合成及運(yùn)動(dòng)能力，使APEC運(yùn)動(dòng)性下降，RyhB基因缺失影響flgD、fliF、flhB、cheY、 fliM基因轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)cysE基因調(diào)控菌株運(yùn)動(dòng)能力具有代償作用。具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）