• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    遼寧省番茄上番茄斑駁花葉病毒的分子鑒定

    2020-12-09 05:31涂麗琴吳淑華高丹娜吉穎程兆榜周益軍朱月林劉勇季英華
    江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年5期
    關(guān)鍵詞:分子鑒定番茄

    涂麗琴 吳淑華 高丹娜 吉穎 程兆榜 周益軍 朱月林 劉勇 季英華

    摘要:為明確2015年在遼寧省調(diào)查番茄病毒病時發(fā)現(xiàn)的病毒類型,對田間采集的番茄病樣進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果顯示,在用煙草花葉病毒屬通用檢測引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時22份樣品中有6份擴(kuò)增到800 bp左右的目的片段,擴(kuò)增產(chǎn)物測序后BLAST分析結(jié)果表明它與已報道的番茄斑駁花葉病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)(KF477193)同源性最高,為99.2%。為進(jìn)一步確認(rèn),針對ToMMV編碼的外殼蛋白(CP)設(shè)計了一對特異性引物,對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示6份陽性樣品都能擴(kuò)增到目的條帶,對其克隆測序后發(fā)現(xiàn)CP基因序列全長480 bp,編碼1個相對分子質(zhì)量約1.77×104的蛋白質(zhì),系統(tǒng)進(jìn)化樹表明該病毒與ToMMV的同源性最高,共同聚類于一個分支。這些結(jié)果表明在遼寧省番茄病株上檢測到的病毒為ToMMV的1個分離物,這是在遼寧省番茄上發(fā)現(xiàn)番茄斑駁花葉病毒的首次報道。

    關(guān)鍵詞:番茄斑駁花葉病毒;分子鑒定;番茄

    中圖分類號:S436.412.1+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1000-4440(2020)05-1126-07

    Abstract:To clarify the types of viruses found in the process of investigation on tomato virus diseases from Liaoning province in 2015, the infected tomato samples collected in the fields were detected by molecular methods. The results showed that the target fragment of approximately 800 bp long was amplified from six samples of twenty-two samples in the process of RT-PCR amplification, using universal primers for Tobamovirus. The amplified products were sequenced and the results of BLAST analysis showed that, the sequence showed the highest homology with the reported tomato mottle mosaic virus (ToMMV) (KF477193), with a value of 99.2%. To make further confirmation of the above result, a pair of specific primers based on coat protein (CP) sequence coded by ToMMV were designed and used to do RT-PCR detection of the samples. The results showed that the target band could be amplified from six positive samples. The cloning and sequencing results of the target band revealed that the full length of CP gene was 480 bp, encoding a protein with a relative molecular weight of approximately 1.77×104. The results of the phylogenetic tree indicated that the virus sequence showed the highest homology with ToMMV and they all clustered into one branch. The above results indicate that the virus detected in infected tomatoes from Liaoning is an isolate of ToMMV, and this is the first report of ToMMV found in tomatoes from Liaoning province.

    Key words:tomato mottle mosaic virus;molecular identification;tomato

    番茄(Solanum lycopersicum)為主要的茄科蔬菜作物之一,廣泛種植于世界上多個國家與地區(qū)。目前已發(fā)現(xiàn)可感染為害番茄的病毒種類大概為146種[1],常見的有黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow leaf curl virus,TYLCV)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)等[1-4]。2013年Li等[5]在墨西哥番茄上發(fā)現(xiàn)一種新病毒——番茄斑駁花葉病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV),該病毒侵染番茄會導(dǎo)致植株出現(xiàn)發(fā)育遲緩、頂端壞死等癥狀,病葉出現(xiàn)斑駁、皺縮和壞死等癥狀,其果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)顯著下降,對番茄產(chǎn)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6],隨后美國[7-8]、以色列[9]、西班牙[5]、巴西[10]等地陸續(xù)出現(xiàn)該病毒的危害報道。2014年中國西藏地區(qū)出現(xiàn)該病毒[11],之后云南、海南等地陸續(xù)出現(xiàn)該病毒[12-13],給各地的茄果類蔬菜作物生產(chǎn)造成了極大的影響。

    ToMMV隸屬于帚狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus),為正義單鏈RNA(+ ssRNA)病毒,其基因組全長約為6 400 bp,含4個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)并編碼4個大小各異的蛋白質(zhì),分別為1.83×105的RNA依賴的RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)、1.26×105的甲基轉(zhuǎn)移酶/解旋酶蛋白(Methyltransferase/helicase)、2.98×104的運(yùn)動蛋白(Movement protein,MP)以及1.77×104的外殼蛋白(Coat protein,CP)[13]。其中甲基轉(zhuǎn)移酶/解旋酶蛋白由琥珀(UAG)終止密碼子終止,RNA依賴的RNA聚合酶蛋白通過通讀此終止密碼子產(chǎn)生,這2個較大的蛋白質(zhì)能組成RNA復(fù)制蛋白復(fù)合體,參與病毒的復(fù)制[14]。

    2015年我們在開展遼寧省番茄病害的調(diào)查研究時觀察到田間出現(xiàn)類似病毒感染癥狀的植株,病樣采集后通過RT-PCR、基因克隆和測序等對其進(jìn)行分子檢測與鑒定。

    1材料與方法

    1.1供試病樣

    供試番茄病樣于2015年7月采自遼寧省沈陽市(累計22份),以溫室內(nèi)培育的健康番茄為對照,病樣采集后分別取100 mg至不同的磨樣管中并做好標(biāo)記,將磨樣管置于液氮中進(jìn)行速凍后快速將其置于-80 ℃冰箱。

    1.2主要試劑與儀器

    RNA提取液(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)、Ex Taq酶和基因克隆T載體pMD 18-T購自大連TaKaRa公司,2×Taq Master Mix購自南京Vazyme公司,大腸桿菌菌株Top10購自南京Warbio公司,質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司,限制性內(nèi)切酶BamH I購自美國New England Biolabs公司,引物送至上海Invitrogen公司合成,其余有機(jī)和無機(jī)試劑為國產(chǎn)分析純。

    全自動樣品磨樣儀(Tissue lyser-64)購自上海凈信科技公司。

    1.3病樣總RNA提取

    取-80 ℃冰箱中放置的番茄病樣磨樣管,經(jīng)液氮冷凍后用全自動樣品磨樣儀將管中病樣磨成粉末,按照Trizol法[15]利用RNAiso Plus提取番茄樣品的總RNA,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4病毒RT-PCR檢測

    利用番茄病樣總RNA作模板,用PrimerScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μl):2 μl 5×Primer ScriptTM RT Master Mix,病樣RNA 500 ng,最后用RNase Free ddH2O補(bǔ)足至總體積為10 μl,輕輕混勻;反應(yīng)程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃結(jié)束,得到cDNA。隨后對其進(jìn)行PCR檢測,PCR體系(20 μl):10 μl 2×Taq Master Mix,1 μl 10 μmol/L Tob-Uni1(表1),1 μl 10 μmol/L Tob-Uni2,1 μl cDNA,7 μl ddH2O,輕輕混勻;反應(yīng)程序:94 ℃高溫變性5 min;94 ℃ 45 s,49 ℃ 45 s,72 ℃ 55 s,33個循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃ 結(jié)束。取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物于0.5×TAE電泳緩沖液中,用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,根據(jù)電泳結(jié)果將其產(chǎn)物送至測序公司測序。

    1.5ToMMV CP基因克隆

    根據(jù)番茄斑駁花葉病毒外殼蛋白序列設(shè)計特異引物ToMM CP_F和ToMM CP_R(表1),對上述檢測結(jié)果為陽性的病樣cDNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(25 μl):0.5 μl 5 U/μl Ex Taq,2.5 μl 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ plus),1.0 μl 10 μmol/L ToMM CP_F,1.0 μl 10 μmol/L ToMM CP_R,0.5 μl 10 mmol/L dNTP mix,1.0 μl cDNA模板,18.5 μl ddH2O,輕輕混勻;反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 35 s,33個循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃ 保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用凝膠回收試劑盒回收凝膠中的擴(kuò)增帶。按照pMD 18-T載體連接試劑盒說明書將回收產(chǎn)物連接至T載體,其產(chǎn)物經(jīng)42 ℃熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top 10后涂于含200 mg/L氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體平板上,隨后將其倒置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右,挑取LB板上的單克隆進(jìn)行菌落PCR和單酶切驗證,驗證后送至測序公司進(jìn)行序列測定。

    1.6序列測定與分析

    委托安徽通用生物有限公司對擴(kuò)增序列進(jìn)行測定。使用ClustalX、BioEdit和DNAstar分析軟件以及NCBI上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)對序列進(jìn)行比對等分析。使用MEGA6軟件對其系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果進(jìn)行分析,進(jìn)化樹的置信度用1 000次Bootstrap評價。

    2結(jié)果與分析

    2.1疑似病毒病的番茄病害田間癥狀

    2015年7月,筆者在遼寧省進(jìn)行番茄病害調(diào)查研究時發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)胤阎仓瓿霈F(xiàn)類似病毒病感染的癥狀,其果實(shí)呈現(xiàn)無規(guī)則壞死斑,早期呈灰白色,后期深褐色,有些病株會伴有葉片變小、皺縮和黃化等癥狀(圖1)。病株果實(shí)的壞死斑硬化,壞死斑塊上未發(fā)現(xiàn)霉層或菌核,初步懷疑是病毒病侵染危害。

    2.2番茄病樣中病毒的分子檢測

    對番茄病樣RNA進(jìn)行RT-PCR檢測以確定其感染的病毒種類。結(jié)果表明在利用煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)通用引物Tob-Uni1與Tob-Uni2進(jìn)行檢測時,采集的22份番茄樣品中有6份樣品擴(kuò)增到約800 bp的目的條帶,且健康番茄植株無該條帶(圖2),說明番茄病樣中可能有煙草花葉病毒屬病毒的感染。為進(jìn)一步明確其病毒類型,我們抽選6份樣品中的部分樣品進(jìn)行序列測定,序列BLAST分析結(jié)果顯示其與ToMMV(KF477193,99.2%)的同源性最高,說明檢測到的病毒可能是ToMMV的1個分離物。

    2.3番茄病樣中ToMMV的分子檢測

    為明確上述病毒是否為ToMMV的1個分離物,我們針對ToMMV CP基因設(shè)計出特異性擴(kuò)增引物ToMM CP_F與ToMM CP_R。RT-PCR結(jié)果顯示6份陽性樣品都能擴(kuò)增到和預(yù)期目的片段大小(480 bp)接近的特異性條帶(圖3),表明該條帶為特異性的CP基因擴(kuò)增條帶。這進(jìn)一步說明遼寧省番茄病樣中檢測到的病毒可能是ToMMV。

    2.4番茄病樣ToMMV CP基因序列分析

    對所有陽性樣品擴(kuò)增到的ToMMV CP基因片段進(jìn)行克隆,并隨機(jī)選取3個樣品(樣品4、12、18)進(jìn)行Bam H I單酶切驗證(圖3)。對6個陽性樣品的ToMMV CP基因克隆進(jìn)行序列測定,分析結(jié)果表明其序列全長480 bp,編碼1個大小約1.77×104的蛋白質(zhì)。序列比對分析結(jié)果顯示6個分離物之間的同源性在99.4%至100.0%之間,BLAST分析結(jié)果表明它們與ToMMV的同源性最高,表明該病毒屬ToMMV分離物。

    為進(jìn)一步解析其分類地位,利用MEGA6將本試驗測定序列與目前已公布的ToMMV CP序列(表2)比對后進(jìn)行聚類分析,以同屬的ToMV(NC_002692)、番茄褐色皺紋果病毒(Tomato brown rugose fruit virus,TBRV)(NC_028478)、地黃花葉病毒(Rehmannia mosaic virus,RheMV)(NC_009041)、TMV(NC_001367)作為外群,使用Kimura 2- parameter模型和臨近法(Neighbor-Joining,NJ)重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明本研究測定的6個分離物(4、11、12、14、18、21)的CP序列全部聚類到ToMMV分支中,與其他ToMMV分離物的同源性在98.5%至99.8%之間。這些結(jié)果進(jìn)一步說明遼寧省番茄上檢測到的病毒為ToMMV。

    3討論

    番茄斑駁花葉病毒是近年來新發(fā)生的一種植物病毒,對多個國家包括番茄在內(nèi)的多種作物造成了嚴(yán)重?fù)p失。中國自2014年首次報道該病毒發(fā)生危害以來,目前至少已有7個省(市)出現(xiàn)該病毒發(fā)生危害[11-13],其中番茄上僅海南有發(fā)生危害的報道[17]。本研究2015年在對遼寧省番茄上病毒病進(jìn)行調(diào)查時,在當(dāng)?shù)胤焉蠙z測到ToMMV,為遼寧省番茄上發(fā)現(xiàn)該病毒的首次報道。

    除番茄[12]外,也有報道顯示ToMMV自然條件下還可以侵染危害辣椒[11]、茄子[13]等茄果類蔬菜作物,而室內(nèi)接種試驗結(jié)果顯示ToMMV除侵染危害上述作物外,還可以侵染假酸漿、酸漿、矮牽牛、本氏煙、黃花煙草、大白菜、青菜、蘿卜、青花菜、花椰菜、油菜、擬南芥、野生昆諾黎等多種植物[5,11]。ToMMV作為煙草花葉病毒屬成員之一,它亦可以通過汁液摩擦等方式傳播擴(kuò)散,而且有些作物上已有報道種子亦可攜帶病毒[18],因而其寄主種類與范圍可能比較廣泛[11]。在對不同品種之間的抗病性進(jìn)行評估時發(fā)現(xiàn)ToMMV比ToMV更容易侵染一些番茄品種,并產(chǎn)生更嚴(yán)重的癥狀[19]。因此在生產(chǎn)上要密切關(guān)注ToMMV的發(fā)生動態(tài),加強(qiáng)種苗檢疫,早發(fā)現(xiàn),早防控,減少損失。

    番茄是公認(rèn)的世界范圍廣泛種植的重要蔬菜作物之一,生產(chǎn)中已發(fā)現(xiàn)的能侵染并危害番茄的病毒種類多達(dá)146種[1,20-22],這些病毒通過單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染的方式危害番茄,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì),降低其經(jīng)濟(jì)價值,從而限制番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此本研究在對遼寧省番茄上病毒病進(jìn)行調(diào)查時,除ToMMV外,也對采集的病樣中的其他病毒如煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜花葉病毒等進(jìn)行了檢測,在有些病樣中也檢測到番茄花葉病毒等病毒。這些結(jié)果一方面說明當(dāng)?shù)胤焉喜《痉N類可能比較復(fù)雜,要明確當(dāng)?shù)胤焉喜《痉N類需要更廣泛的樣本采集及更系統(tǒng)的病毒種類調(diào)查;另一方面本研究從田間采集的病樣中檢測到ToMMV,但ToMMV是否為導(dǎo)致番茄出現(xiàn)田間癥狀的主要原因還有待于進(jìn)一步的病毒分離及回接試驗驗證。

    參考文獻(xiàn):

    [1]HANSSEN I M, LAPIDOT M, THOMMA B P. Emerging viral diseases of tomato crops[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2010, 23: 539-548.

    [2]MOUSSA A B, MAKNI M, MARRAKCHI M. Identification of the principal viruses infecting tomato crops in Tunisia[J]. European and Mediterranean Plant Protection Organization Bulletin, 2010, 30(2): 293-296.

    [3]PARRELLA G, CRESCENZI A. The present status of tomato viruses in Italy[J]. Acta Horticlturae, 2005, 695: 37-42.

    [4]MASSUMI H, SHAABANIAN M, POUR A H, et al. Incidence of viruses infecting tomato and their natural hosts in the southeast and central regions of Iran[J]. Plant Disease, 2009, 93(1): 67-72.

    [5]LI R, GAO S, FEI Z, et al. Complete genome sequence of a new tobamovirus naturally infecting tomatoes in Mexico[J]. Genome Announcements, 2013, 1(5): e00794.

    [6]AMBRS S, MARTNEZ F, IVARS P, et al. Molecular and biological characterization of an isolate of Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) infecting tomato and other experimental hosts in eastern Spain[J]. European Journal of Plant Pathology, 2017, 149(2): 261-268.

    [7]FILLMER K, ADKINS S, PONGAM P, et al. Complete genome sequence of a Tomato mottle mosaic virus isolate from the United States[J]. Genome Announcements, 2015, 3(2): e00167-15.

    [8]PADMANABHAN C, ZHENG Y, LI R, et al. Complete genome sequence of a tomato-infecting tomato mottle mosaic virus in New York[J]. Genome Announcements, 2015, 3(6): e01523-15.

    [9]TURINA M, GERAATS B P J, CIUFFO M. First report of tomato mottle mosaic virus in tomato crops in Israel[J]. New Disease Reports, 2016, 33: 1.

    [10]NAGAI A, DUARTE L, CHAVES A, et al. First Complete genome sequence of an isolate of tomato mottle mosaic virus infecting plants of Solanum lycopersicum in South America.[J]. Genome Announcements, 2018, 6(19): e00427-18.

    [11]LI Y Y, WANG C L, XIANG D, et al. First report of tomato mottle mosaic virus infection of pepper in China[J]. Plant Disease, 2014, 98(10): 1447.

    [12]LI Y Y, WANG Y, HU J, et al. The complete genome sequence, occurrence and host range of tomato mottle mosaic virus Chinese isolate[J]. Virology Journal, 2017, 14(1): 15.

    [13]CHE H Y, LUO D Q, CAO X R, et al. First report of tomato mottle mosaic virus in tomato crops in China[J]. Plant Disease, 2018, 102(10): 2051.

    [14]LARTEY R T, VOSS T C, MELCHER U. Tobamovirus evolution: gene overlaps, recombination, and taxonomic implications[J]. Molecular Biology and Evolution, 1996, 13(10): 1327-1338.

    [15]吳淑華,趙文浩,李廷芳,等. 南京辣椒上一種斑駁類型病毒病的分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015, 31(6): 1284-1290.

    [16]LETSCHERT B, ADAM G, LESEMANN D E, et al. Detection and differentiation of serologically cross-reacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP[J]. Journal of Virological Methods, 2002, 106(1): 1-10.

    [17]ZHAN B H, CAO N, WANG K N, et al. Detection and characterization of an isolate of tomato mottle mosaic virus infecting tomato in China[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2018, 17(5): 1207-1212.

    [18]LOVELOCK D A, KINOTI W M, BOTTCHER C, et al. Tomato mottle mosaic virus intercepted by Australian biosecurity in Capsicum annuum seed[J]. Australasian Plant Disease Notes, 2020, 15(1): 8.

    [19]NAGAI A, DUARTE L M L, CHAVES A L R, et al. Tomato mottle mosaic virus in Brazil and its relationship with Tm-22 gene[J]. European Journal of Plant Pathology, 2019, 155: 353-359.

    [20]魯清華,張宇,張松柏,等. 湖南省長沙市番茄黃化曲葉病毒的檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2018, 49(7):1332-1337.

    [21]鄭雪,陳勇,鄭立敏,等. 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒侵染辣椒揮發(fā)物成分分析及對西花薊馬行為反應(yīng)影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2018, 50(11):111-115.

    [22]姜靜,王銀磊,李亞茹,等. 江蘇省及其他地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2018,34(1):238-240.

    (責(zé)任編輯:張震林)

    猜你喜歡
    分子鑒定番茄
    番茄鱈魚面
    小番茄發(fā)電機(jī)
    HOME家系列
    徐州四種市售食用菌的分子鑒定
    ITS2序列分析在白花蛇舌草鑒定中的應(yīng)用研究
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    編輯部故事
    愛挑剔的番茄
    番茄
    国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 97在线人人人人妻| 天天添夜夜摸| 一区二区三区精品91| 国产色视频综合| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产福利在线免费观看视频| 免费观看av网站的网址| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 中文字幕人妻熟女乱码| 最近最新免费中文字幕在线| 两性夫妻黄色片| 操出白浆在线播放| 精品国产一区二区久久| 一进一出抽搐动态| 三级毛片av免费| 午夜老司机福利片| 高清在线国产一区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美在线黄色| av线在线观看网站| 新久久久久国产一级毛片| 成年动漫av网址| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 另类亚洲欧美激情| 亚洲,欧美精品.| 大香蕉久久网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 老司机在亚洲福利影院| 黄色 视频免费看| 国产成人系列免费观看| 另类亚洲欧美激情| 大香蕉久久成人网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 99国产综合亚洲精品| 热99re8久久精品国产| 国产av国产精品国产| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 自线自在国产av| 国产三级黄色录像| 亚洲免费av在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产日韩欧美亚洲二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久精品94久久精品| 午夜91福利影院| 18禁观看日本| 丝袜美腿诱惑在线| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲五月色婷婷综合| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品免费大片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 两个人免费观看高清视频| 天天操日日干夜夜撸| 一级片'在线观看视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产熟女午夜一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 精品亚洲成国产av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美国产精品一级二级三级| 婷婷成人精品国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久九九热精品免费| 国产精品一区二区免费欧美 | 99久久精品国产亚洲精品| 丰满少妇做爰视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 电影成人av| 欧美国产精品一级二级三级| 黄色 视频免费看| 岛国毛片在线播放| bbb黄色大片| 91精品伊人久久大香线蕉| 自线自在国产av| 黄色视频,在线免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 青草久久国产| 亚洲欧美一区二区三区久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 十八禁网站免费在线| 久久香蕉激情| 大片免费播放器 马上看| 日本五十路高清| 国产亚洲精品久久久久5区| 91麻豆av在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产色视频综合| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲 国产 在线| 黄色视频,在线免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产一级毛片在线| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美精品av麻豆av| 亚洲精品国产av蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 99热全是精品| av有码第一页| 老司机午夜福利在线观看视频 | 亚洲全国av大片| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99国产精品一区二区三区| avwww免费| 超色免费av| 国精品久久久久久国模美| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩欧美免费精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 中文字幕制服av| 老司机影院毛片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 中文字幕制服av| 国产av精品麻豆| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 伊人亚洲综合成人网| 91老司机精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一级,二级,三级黄色视频| 我的亚洲天堂| 国产又爽黄色视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区激情短视频 | a级片在线免费高清观看视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 老司机影院成人| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜激情av网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 视频区图区小说| 99久久综合免费| 美女中出高潮动态图| 久久精品亚洲av国产电影网| 一本综合久久免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 婷婷丁香在线五月| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产亚洲精品久久久久5区| av一本久久久久| 午夜视频精品福利| 亚洲精品美女久久av网站| 久久免费观看电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲av美国av| 久久性视频一级片| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜免费鲁丝| 久久久精品区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄片播放在线免费| 人妻人人澡人人爽人人| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲国产精品999| 久久精品成人免费网站| 亚洲欧洲日产国产| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一级片免费观看大全| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 高清欧美精品videossex| 亚洲 国产 在线| 国产精品av久久久久免费| 99精品久久久久人妻精品| 看免费av毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 中国国产av一级| 欧美黄色淫秽网站| 水蜜桃什么品种好| 免费在线观看完整版高清| 亚洲熟女精品中文字幕| 黄片播放在线免费| 久热爱精品视频在线9| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久精品94久久精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久热这里只有精品99| 一区二区三区精品91| 亚洲精品国产一区二区精华液| netflix在线观看网站| 搡老岳熟女国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一本久久精品| videos熟女内射| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩中文字幕视频在线看片| 免费日韩欧美在线观看| 国产在线观看jvid| 国产免费福利视频在线观看| 国产区一区二久久| 老司机影院成人| 精品视频人人做人人爽| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产高清国产精品国产三级| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清视频免费观看一区二区| 欧美国产精品一级二级三级| 日韩视频在线欧美| e午夜精品久久久久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美xxⅹ黑人| 咕卡用的链子| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人啪精品午夜网站| 老熟女久久久| 最黄视频免费看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 日本wwww免费看| 久久国产精品影院| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜福利视频精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产一区有黄有色的免费视频| tocl精华| 久久人人爽人人片av| 国产有黄有色有爽视频| 中文字幕av电影在线播放| 蜜桃在线观看..| 欧美一级毛片孕妇| www.自偷自拍.com| 精品国产乱码久久久久久小说| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜福利视频精品| 大香蕉久久网| 一区二区三区四区激情视频| 91精品三级在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| av欧美777| 亚洲免费av在线视频| 午夜视频精品福利| 一区二区三区精品91| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产男女超爽视频在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩欧美一区视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品人妻1区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 一级片免费观看大全| 中文字幕精品免费在线观看视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久久久久精品精品| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99久久国产精品久久久| 妹子高潮喷水视频| 久久性视频一级片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av欧美aⅴ国产| 高清欧美精品videossex| 国产精品一区二区在线观看99| 两个人看的免费小视频| 亚洲av美国av| 天堂8中文在线网| 久久久精品免费免费高清| av又黄又爽大尺度在线免费看| 999精品在线视频| 国产成人影院久久av| 丝袜美足系列| 久热这里只有精品99| 精品久久久久久电影网| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久精品人妻al黑| 99精品久久久久人妻精品| 一本久久精品| 人妻 亚洲 视频| 美女主播在线视频| 无限看片的www在线观看| 欧美午夜高清在线| 一区二区av电影网| 老司机在亚洲福利影院| 日本黄色日本黄色录像| 在线av久久热| 99热全是精品| 黄色视频,在线免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 少妇粗大呻吟视频| 久久99一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 日韩大片免费观看网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一个人免费在线观看的高清视频 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 黑人猛操日本美女一级片| 日本欧美视频一区| 成人三级做爰电影| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 色综合欧美亚洲国产小说| 嫩草影视91久久| 在线观看免费午夜福利视频| 好男人电影高清在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 成人国语在线视频| 国产在线观看jvid| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 最新在线观看一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 一本色道久久久久久精品综合| 精品人妻1区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 在线观看人妻少妇| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91成人精品电影| 极品人妻少妇av视频| 久久精品国产a三级三级三级| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲成人手机| 国产91精品成人一区二区三区 | 两人在一起打扑克的视频| 少妇 在线观看| 久久久精品免费免费高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜老司机福利片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久国产精品大桥未久av| 一级毛片电影观看| 老熟女久久久| 国产黄色免费在线视频| 91九色精品人成在线观看| 两个人免费观看高清视频| 国产麻豆69| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜免费鲁丝| 久热这里只有精品99| 桃花免费在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人av激情在线播放| 精品视频人人做人人爽| 后天国语完整版免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 黄色a级毛片大全视频| 一区福利在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 热re99久久精品国产66热6| 日本a在线网址| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 午夜免费鲁丝| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜91福利影院| 免费观看人在逋| 不卡av一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | a级毛片黄视频| 久久久久久久久久久久大奶| 午夜激情av网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲中文字幕日韩| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| kizo精华| av在线播放精品| 成人免费观看视频高清| 我要看黄色一级片免费的| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩 亚洲 欧美在线| 超色免费av| 免费在线观看影片大全网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 无遮挡黄片免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久精品免费免费高清| 久久影院123| 99精品欧美一区二区三区四区| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 在线观看免费日韩欧美大片| 飞空精品影院首页| e午夜精品久久久久久久| 国产又爽黄色视频| 多毛熟女@视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一级毛片电影观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人国语在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 狂野欧美激情性bbbbbb| 满18在线观看网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 日本黄色日本黄色录像| 国产高清国产精品国产三级| 人妻 亚洲 视频| 2018国产大陆天天弄谢| av线在线观看网站| 欧美日韩一级在线毛片| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av片天天在线观看| 黄片小视频在线播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 婷婷色av中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 手机成人av网站| 免费观看人在逋| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费少妇av软件| 色婷婷av一区二区三区视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久九九热精品免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 高清欧美精品videossex| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av片天天在线观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品一区二区三卡| 精品第一国产精品| 大陆偷拍与自拍| 97人妻天天添夜夜摸| tocl精华| 欧美av亚洲av综合av国产av| 高清在线国产一区| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲一区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲情色 制服丝袜| 久久国产精品大桥未久av| 曰老女人黄片| 久9热在线精品视频| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品二区激情视频| 我要看黄色一级片免费的| 18在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 美女扒开内裤让男人捅视频| 在线天堂中文资源库| 老司机深夜福利视频在线观看 | 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 一级a爱视频在线免费观看| 十八禁人妻一区二区| 久久久久久久国产电影| 夜夜夜夜夜久久久久| 考比视频在线观看| 热re99久久国产66热| 满18在线观看网站| 国产成人欧美| 黄片播放在线免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美日韩av久久| 99香蕉大伊视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 9色porny在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 五月天丁香电影| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲第一av免费看| 午夜免费鲁丝| 久久人妻熟女aⅴ| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 两个人免费观看高清视频| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩人妻精品一区2区三区| 18禁观看日本| svipshipincom国产片| 女性生殖器流出的白浆| av免费在线观看网站| 操出白浆在线播放| 成年动漫av网址| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黄频高清免费视频| 九色亚洲精品在线播放| 日本wwww免费看| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品少妇内射三级| 国产黄色免费在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人欧美在线观看 | 国产av一区二区精品久久| 丁香六月欧美| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲 国产 在线| 免费av中文字幕在线| 国产精品一区二区在线观看99| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产又色又爽无遮挡免| 91九色精品人成在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品乱久久久久久| 日本黄色日本黄色录像| 精品福利观看| 99久久精品国产亚洲精品| 久久av网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成年人黄色毛片网站| 在线观看一区二区三区激情| 一级毛片女人18水好多| 美女大奶头黄色视频| 999久久久国产精品视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲性夜色夜夜综合| 激情视频va一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 大香蕉久久网| 秋霞在线观看毛片| 性少妇av在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 99精品久久久久人妻精品| 两个人免费观看高清视频| 久久精品国产综合久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产在线观看jvid| 黄色毛片三级朝国网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品人妻1区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产男女内射视频| 国产av精品麻豆| 丝袜在线中文字幕| 高清av免费在线| 国产精品九九99| 亚洲精品第二区| 国产成人免费观看mmmm| 欧美日本中文国产一区发布| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人av教育| 亚洲第一青青草原| 久久久久网色| 热99re8久久精品国产| 国产不卡av网站在线观看| 欧美性长视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久精品免费免费高清| 亚洲专区字幕在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 91麻豆av在线| 91成年电影在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品国产一区二区精华液| 黑丝袜美女国产一区| 悠悠久久av| 一级毛片电影观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 性色av一级| 大片电影免费在线观看免费|