龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究進(jìn)展

陳裕坤 林曉藝 賴鐘雄

摘? 要：龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)是研究木本植物胚胎發(fā)生的優(yōu)良體系，為研究龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制和龍眼分子育種奠定基礎(chǔ)。本文就龍眼胚性愈傷組織誘導(dǎo)與離體保存、高頻體胚發(fā)生與植株再生、體胚同步化調(diào)控與組織形態(tài)學(xué)觀察，體胚發(fā)生過程生理生化變化與代謝物積累、蛋白質(zhì)組和全轉(zhuǎn)錄組測序分析、DNA甲基化研究，體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、全基因組鑒定及其表達(dá)模式與功能，以及遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究進(jìn)行綜述，并對(duì)其研究前景進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：龍眼;體胚發(fā)生;基因克隆;分子機(jī)制;全轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué);DNA甲基化

中圖分類號(hào)：S667.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Longan somatic embryogenesis （SE） system is an excellent system for studying embryogenesis in woody plants， which lays the foundation for studying the molecular regulation mechanism during SE and molecular breeding of longan. Accordingly， the induction of embryogenic callus and in vitro conservation， high-frequency SE and plant regeneration， regulation of synchronization somatic embryo and histomorphological observation in longan， the physiological， biochemical changes， and metabolite accumulation， proteomic and whole transcriptomics analysis by RNA-seq， DNA methylation during SE， SE-related genes cloning and genome-wide identification， expression pattern and function study of SE-related genes， research on genetic transformation of SE system in longan， were reviewed in this paper. Meanwhile， the research prospect of longan SE was analyzed and prospected.

Keywords： Dimocarpus longan Lour.; somatic embryogenesis; gene cloning; molecular mechanism; whole-transcriptomics and proteomics; DNA methylation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.006

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國著名的熱帶亞熱帶特色木本果樹，龍眼果實(shí)富含酚類等次生代謝物，被譽(yù)為“南方人參”。龍眼原產(chǎn)于中國和東南亞，在東南亞、南亞、澳大利亞和夏威夷等地均有較大規(guī)模的種植[1]。我國栽培龍眼的歷史可追溯到2000多年以前，種植龍眼的省（區(qū)）包括廣東、廣西、福建、四川、云南和海南，但主產(chǎn)區(qū)在廣東、廣西和福建3個(gè)?。▍^(qū)）[2]。龍眼合子胚的生長發(fā)育狀況與其產(chǎn)量、種子大小、果實(shí)品質(zhì)等生產(chǎn)性狀息息相關(guān)，由于龍眼樹體高大，合子胚被果實(shí)胚囊包裹在中間，并且在子葉胚形成前合子胚極其細(xì)小，無法實(shí)時(shí)觀測合子胚的發(fā)育狀況，導(dǎo)致龍眼合子胚發(fā)育中期階段之前的材料取材困難[3]。同時(shí)，龍眼具有童期長、遺傳背景復(fù)雜、高度雜合的特點(diǎn)，極大限制了分子生物學(xué)在龍眼合子胚胚胎發(fā)育研究上的應(yīng)用。植物體細(xì)胞胚胎（體胚）發(fā)生過程和合子胚胚胎發(fā)生過程的發(fā)育階段高度相似[4-5]，體胚發(fā)生是植物胚胎發(fā)生特別是胚胎發(fā)育早期分子調(diào)控機(jī)制研究的模式系統(tǒng)[6]。賴鐘雄等[7-8]建立的龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)具有高度同步、高頻率發(fā)生和再生能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是研究木本植物胚胎發(fā)生的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。20多年來，福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所在龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了大量研究，包括龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、全基因組鑒定，體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)模式與功能研究，蛋白質(zhì)組學(xué)分析，全轉(zhuǎn)錄組測序分析，DNA甲基化研究，龍眼體胚發(fā)生過程lncRNA、microRNA、miPEP、cirRNA研究，龍眼體胚遺傳轉(zhuǎn)化研究等。Lin等[9]于2017年首次完成了龍眼全基因組測序，建立了無患子科植物的第一個(gè)全基因組數(shù)據(jù)庫，為研究龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制提供完整的基因組信息。本文就龍眼體胚發(fā)生各方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1? 龍眼體胚發(fā)生研究進(jìn)展

1.1? 龍眼胚性愈傷組織誘導(dǎo)與離體保存

在20世紀(jì)80年代初，研究人員就已經(jīng)開始進(jìn)行龍眼體胚發(fā)生與植株再生等方面的研究。魏文雄等[10]以‘東壁和‘紅核子幼胚子葉為外植體首次誘導(dǎo)出愈傷組織，但僅在少數(shù)愈傷組織中產(chǎn)生胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞通過體胚發(fā)生途徑獲得完整植株;楊永青等[11]以‘東壁花藥為材料誘導(dǎo)胚性愈傷組織（embryogenic callus， EC），由EC分化的胚狀體再萌發(fā)成正?；ǚ壑仓辏?jīng)根尖細(xì)胞鏡檢獲得單倍體龍眼植株（n=15）;周麗儂等[12]以無菌初生幼苗和自然萌發(fā)實(shí)生苗的不同組織部位為外植體，誘導(dǎo)獲得愈傷組織，但只有莖段誘導(dǎo)的愈傷組織可分化成芽，以及側(cè)芽和頂芽誘導(dǎo)的部分愈傷組織可分化成根;楊永青等[13]從焦核龍眼幼胚的離體培養(yǎng)中獲得胚狀體，通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株，實(shí)現(xiàn)焦核龍眼的胚胎挽救。此外，Litz[14]從樹齡超過30年的龍眼樹幼葉離體培養(yǎng)中獲得EC，經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。因此，已經(jīng)成功從龍眼的子葉幼胚、花藥和葉片等組織部位誘導(dǎo)出龍眼EC，并經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株，但部分胚性愈傷組織的穩(wěn)定性和體胚發(fā)生能力較差，甚至出現(xiàn)畸形胚，體胚發(fā)生頻率較低、數(shù)量較少，制約了龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化及分子生物學(xué)等系統(tǒng)研究。

20世紀(jì)90年代初，賴鐘雄等[1， 8]以‘紅核子‘油譚本‘東壁‘十二月龍眼‘九月烏等龍眼未成熟果幼胚和‘東壁等龍眼的花藥為外植體，誘導(dǎo)出CI類型，CIIa、CIIb類型，CIII類型的愈傷組織，CIIa、CIIb類型愈傷組織經(jīng)4～5次繼代培養(yǎng)也可選擇出松散型的CIII型愈傷組織，CIIa、CIIb類型和CIII類型的愈傷組織體胚發(fā)生能力極強(qiáng)，經(jīng)過1個(gè)月左右的培養(yǎng)，每克鮮樣可分化出約1萬個(gè)胚狀體;以MS為基本培養(yǎng)基分別添加1.0 mg/L 2，4-D與1.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT、5.0 mg/L AgNO3對(duì)松散型胚性愈傷組織進(jìn)行交替培養(yǎng)，可達(dá)到長期繼代保存松散型胚性愈傷組織的目的。葉煒等[15]參照此法，成功從51份龍眼種質(zhì)中誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，并進(jìn)行長期繼代保存。林秀蓮等[16]通過對(duì)離體保存的龍眼EC及其體胚發(fā)生過程染色體數(shù)目變異的研究，發(fā)現(xiàn)二倍體龍眼離體培養(yǎng)物中存在單倍體、三倍體、四倍體、非整倍體等廣泛的變異，這種變異現(xiàn)象從EC誘導(dǎo)開始就存在，并且變異率會(huì)隨離體培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，但最終趨于穩(wěn)定。

1.2? 龍眼高頻體胚發(fā)生及植株再生

賴鐘雄等[7]在獲得3種類型胚性愈傷組織的基礎(chǔ)上，明確了愈傷組織的類型、蔗糖濃度和光照條件是龍眼體胚發(fā)生過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，成功建立了龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)。賴鐘雄等[17]從不同龍眼品種外植體中誘導(dǎo)篩選的CIII型龍眼EC通過液體培養(yǎng)方式都能在2周左右建立胚性懸浮細(xì)胞系，采用分別附加AgNO3和肌醇的液體培養(yǎng)基交替培養(yǎng)及固體-液體輪回培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)了胚性懸浮細(xì)胞系的長期保持，胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基或在液體淺層培養(yǎng)均可獲得大量胚狀體，固體培養(yǎng)基上的胚狀體大小不一致，液體淺層培養(yǎng)的大小比較一致，體胚成熟后獲得再生植株。龍眼松散型胚性愈傷組織經(jīng)過分離獲得單細(xì)胞懸浮細(xì)胞系，龍眼的單細(xì)胞采用液體淺層培養(yǎng)方式，先形成多細(xì)胞團(tuán)，再發(fā)育形成早期球形原胚結(jié)構(gòu)、球形胚結(jié)構(gòu)和子葉形胚結(jié)構(gòu)，最終獲得再生植株[18]。此外，龍眼胚性培養(yǎng)細(xì)胞及胚性懸浮細(xì)胞可獲得高產(chǎn)和高活力的原生質(zhì)體，與懸浮單細(xì)胞培養(yǎng)類似，龍眼原生質(zhì)體通過體胚發(fā)生途徑形成再生植株[19]。賴鐘雄等[20]采用電融合方法將龍眼和荔枝的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，融合率超過20%，融合產(chǎn)物經(jīng)初步培養(yǎng)形成多細(xì)胞團(tuán)。黃淺等[21]進(jìn)行荔枝龍眼原生質(zhì)體的電融合研究，融合率高達(dá)30%以上，建立了荔枝和龍眼原生質(zhì)體的電融合技術(shù)體系，融合產(chǎn)物經(jīng)初步培養(yǎng)形成多細(xì)胞團(tuán)。龍眼這種極強(qiáng)體胚發(fā)生和植株再生能力在木本植物中是十分罕見的，這種優(yōu)良的體胚發(fā)生體系可作為研究植物體胚發(fā)生尤其是木本植物體胚發(fā)生的模式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

1.3? 龍眼體胚發(fā)生同步化調(diào)控與組織形態(tài)學(xué)觀察

體胚發(fā)生的同步化調(diào)控是建立龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在龍眼EC誘導(dǎo)及高頻體胚發(fā)生的基礎(chǔ)上，陳春玲等[22]進(jìn)行了龍眼體胚發(fā)生的同步化調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)龍眼EC在分別添加0.5、0.3、0.1、0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基（蔗糖2%）中培養(yǎng)，可分別獲得高度同步化的不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)、胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)、球形胚和非胚性愈傷組織，將龍眼EC轉(zhuǎn)移至MS基本培養(yǎng)基（蔗糖5%）上培養(yǎng)可獲得高度同步的早期子葉形胚和成熟子葉胚，組織形態(tài)學(xué)研究表明龍眼體胚發(fā)生主要是單細(xì)胞內(nèi)起源。王鳳華等[23]將球形胚接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在培養(yǎng)至第8～9天和第10～12天分別獲得大量同步化的心形胚和魚雷形胚;將龍眼EC接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d獲得大量同步化的子葉形胚，子葉形胚接種于蔗糖含量為5%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)約75 d可獲得成熟體胚。方智振等[24]在獲得高度同步化的球形胚（0.1 mg/L 2，4-D）基礎(chǔ)上，將球形胚接種于添加0.07、0.05、0.06、0 mg/L 2，4-D的MS基本培養(yǎng)基中，分別獲得同步化的心形胚、魚雷形胚和子葉形胚。因此，2，4-D濃度、蔗糖濃度以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)龍眼體胚同步化調(diào)控具有重要的影響，通過對(duì)這3個(gè)因子的調(diào)控可獲得同步化的各個(gè)發(fā)育階段胚性培養(yǎng)物，為龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化變化與代謝物積累、全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、體胚發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控和功能分析等研究奠定基礎(chǔ)。

2? 龍眼體胚發(fā)生過程生理生化變化與代謝物積累

植物激素的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)是體胚發(fā)生和發(fā)育的關(guān)鍵因素，而內(nèi)源激素的代謝與動(dòng)態(tài)平衡對(duì)細(xì)胞分化至關(guān)重要。賴鐘雄等[3]的研究表明，龍眼胚性愈傷組織中內(nèi)源激素含量高于非胚性愈傷組織內(nèi)源激素的含量，從龍眼胚性愈傷組織階段至子葉形胚階段內(nèi)源IAA含量維持在較高水平，且遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織階段，而在成熟子葉胚階段則急劇下降;在非胚性愈傷組織階段的內(nèi)源GA3含量較高，隨著體胚的進(jìn)一步發(fā)育，內(nèi)源GA3的含量逐漸下降;與內(nèi)源IAA和GA3相比內(nèi)源ABA的含量總體較低，在體胚發(fā)生過程ABA含量從球形胚階段開始相對(duì)較高，內(nèi)源玉米素含量的變化趨勢與IAA相似，只是在成熟子葉形胚階段其含量仍維持在較高水平;除GA3外，內(nèi)源激素在胚性愈傷階段II和球形胚階段的含量較高，呈現(xiàn)類“M”的變化趨勢。龍眼體胚發(fā)生過程內(nèi)源多胺含量的研究表明，內(nèi)源多胺與內(nèi)源激素含量的變化趨勢相似，都呈現(xiàn)類“M”的變化趨勢[25]。通過對(duì)龍眼體胚發(fā)生過程的內(nèi)源激素和多胺的研究表明，胚性愈傷階段II和球形胚是其生理生化變化的轉(zhuǎn)折階段，雖然胚性愈傷階段I和階段II在組織形態(tài)學(xué)上沒有差別，但生理生化上已經(jīng)發(fā)生明顯的變化[3]。此外，高濃度蔗糖、光照條件、滲透劑聚乙二醇（PEG）、椰乳和脫落酸等培養(yǎng)因子對(duì)龍眼體胚成熟過程中的可溶性糖、淀粉含量也具有明顯的調(diào)控作用[26]。陳春玲[27]的研究結(jié)果表明，酯酶、過氧化物酶和淀粉酶同工酶酶譜在龍眼體胚發(fā)生過程中的規(guī)律性變化，反應(yīng)出龍眼體胚發(fā)生過程各個(gè)階段遺傳信息表達(dá)的選擇性和順序性。乙醇脫氫酶的含量在龍眼體胚發(fā)生過程中逐漸降低[28]，而抗壞血酸過氧化物酶同工酶含量在胚性愈傷組織、球形胚、子葉形胚階段逐漸遞增[29]。陳義挺等[30]研究表明，隨著龍眼體胚早期發(fā)生（松散型胚性愈傷組織、胚性愈傷II、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)、胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)、球形胚）過氧化物酶（POD）活性呈下降趨勢，低溫或高溫處理下POD酶活性顯著高于對(duì)照，高溫或低溫均可明顯影響POD同工酶譜帶的出現(xiàn)和表達(dá)，POD酶活性及其同工酶譜的規(guī)律性變化可能與龍眼體胚發(fā)生早期的細(xì)胞分化和體胚發(fā)育維持具有密切的關(guān)系。

光調(diào)控是一種改變植物細(xì)胞功能性代謝產(chǎn)物合成的重要方法，采用不同光質(zhì)處理龍眼EC結(jié)果表明，藍(lán)光和白光可以促進(jìn)龍眼EC中多糖、生物素、生物堿和類黃酮的積累，其中藍(lán)光的效果最明顯;與白光和黑暗處理相比，藍(lán)光處理下龍眼EC中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性和過氧化氫酶含量顯著升高，說明光照能激活龍眼EC中的抗氧化系統(tǒng)[31]。李漢生等[32]采用生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)龍眼懸浮細(xì)胞，

研究藍(lán)光和黑暗培養(yǎng)下類黃酮的積累，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光培養(yǎng)9 d后類黃酮含量增長了0.77 mg/g。廖斌等[33]研究不同光照條件對(duì)生物反應(yīng)器中龍眼懸浮細(xì)胞生長及柯里拉京代謝合成的影響，結(jié)果表明黑暗條件利于龍眼胚性懸浮細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)柯里拉京的積累，培養(yǎng)液pH和溶氧是龍眼胚性懸浮細(xì)胞生長及柯里拉京合成的重要調(diào)控因子。崔彤彤[34]研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時(shí)間、溫度和水楊酸（SA）濃度及SA的添加時(shí)間對(duì)龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素積累具有顯著的影響，且在不同溫度和SA濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)龍眼EC中SOD、CAT、POD細(xì)胞保護(hù)酶活性也發(fā)生顯著變化。研究表明，基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑可影響龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素的積累[35];真菌誘導(dǎo)子種類、誘導(dǎo)時(shí)間和濃度影響龍眼EC中多糖的積累，100 mg/L龍眼擬莖點(diǎn)霉誘導(dǎo)子誘導(dǎo)15 d時(shí)龍眼EC多糖含量最高，比對(duì)照提高了61.34%[36];此外，真菌誘導(dǎo)子的種類、誘導(dǎo)時(shí)間和濃度影響龍眼EC中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧的含量[37]。因此，在龍眼體胚不同發(fā)育階段、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基成分、光照條件、植物生長調(diào)節(jié)劑和真菌誘導(dǎo)子等培養(yǎng)條件與龍眼胚性細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)的積累具有密切的關(guān)系。

3? 龍眼體胚發(fā)生分子調(diào)控機(jī)制

3.1? 龍眼體胚發(fā)生蛋白質(zhì)組學(xué)研究

陳春玲等[38]采用IEF和SDS-PAGE技術(shù)分析NEC、EC-Ⅰ、EC-Ⅱ、ICpEC、CpEC、GE、pro-CE、CE 8個(gè)階段的差異表達(dá)蛋白，在等電點(diǎn)pI差異上，EC、pro-CE階段分別檢測出pI 5.1、pI 5.4和pI 4.4特異蛋白;在蛋白質(zhì)相對(duì)分子量差異上，8個(gè)階段的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量分布在6～110 kDa之間，13.9 kDa蛋白是NEC階段的特異蛋白，分子量為6.2 kDa和6.9 kDa的蛋白質(zhì)為CE階段新發(fā)現(xiàn)的特異表達(dá)蛋白。參照此法，王鳳華[39]研究了龍眼體胚發(fā)生過程的差異表達(dá)蛋白，在胚性愈傷組織、球形胚、魚雷形胚、子葉形胚、成熟胚階段分別檢測出1、2、6、4、4個(gè)階段特異表達(dá)蛋白。李冬梅[26]研究表明，龍眼體胚成熟過程和每個(gè)成熟階段均能檢測到特異表達(dá)蛋白，龍眼體胚成熟過程蛋白質(zhì)合成在黑暗+低糖+ABA共同培養(yǎng)條件下最活躍。安娜等[40]研究表明，龍眼體胚發(fā)生過程pI 4～5的酸性蛋白逐漸減少，而pI 5～6的酸性蛋白逐漸增加，在體胚成熟階段，分子量大的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯減少，而分子量小的蛋白質(zhì)數(shù)量逐漸增多。郭玉瓊[41]分析龍眼球形胚低溫預(yù)培養(yǎng)過程的蛋白質(zhì)，鑒定了特異表達(dá)蛋白LLT1、LLT2、LLT3、LLT4;何園[42]在龍眼子葉胚成熟過程中鑒定出29個(gè)差異表達(dá)蛋白，涉及蛋白質(zhì)合成、能量和糖類代謝、脅迫應(yīng)答和抗氧化等過程的相關(guān)蛋白;賴呈純[43]進(jìn)行龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得148個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，最終從118個(gè)差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定中鑒定出45個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì);方智振[44]在龍眼體胚發(fā)生中期蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的種類隨著龍眼體胚的發(fā)育進(jìn)程逐漸減少，從76個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)中選取66個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜分析，共鑒定出35個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中51%的蛋白質(zhì)都涉及代謝途徑，說明龍眼體胚發(fā)生中期蛋白質(zhì)的代謝比較活躍;隨著體細(xì)胞胚的發(fā)育，細(xì)胞不斷分化，體細(xì)胞胚中表達(dá)的蛋白種類減少，氧化脅迫相關(guān)蛋白、RAN2和GTPase ObgE與龍眼體細(xì)胞胚發(fā)生的調(diào)控有關(guān)[45];李然等[46]研究表明，龍眼EC生長過程蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)總體升高，pI介于4～7，蛋白分子量介于14～97 kDa，30～66 kDa的蛋白質(zhì)在龍眼EC生長過程具有相對(duì)較高的表達(dá)量。因此，基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，揭示了龍眼體胚發(fā)生過程的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，共鑒定了162個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分析了差異表達(dá)蛋白所涉及的相關(guān)代謝過程，說明差異表達(dá)蛋白參與龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控。

雖然前期研究已經(jīng)鑒定了部分與體胚發(fā)生相關(guān)的蛋白，揭示了它們在龍眼體胚發(fā)生過程的潛在調(diào)控作用，但所鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量有限，無法全面挖掘差異表達(dá)蛋白在龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，陳裕坤[47]進(jìn)行了iTRAQ標(biāo)記的龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組學(xué)測序分析，在NEC、EC、ICpEC、GE 4個(gè)階段中共鑒定了5035個(gè)蛋白質(zhì)，代謝途徑與次級(jí)代謝物的合成是所鑒定蛋白質(zhì)主要富集的KEGG代謝通路;在NEC與EC、ICpEC、GE成對(duì)比較中分別鑒定出82、78、103個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在EC與ICpEC、GE成對(duì)比較中分別鑒定了73、160個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在ICpEC_與GE成對(duì)比較中鑒定了116個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì);龍眼體胚發(fā)生早期階段差異表達(dá)的LEC1-like、幾丁質(zhì)酶CHI5/-4、阿拉伯半乳聚糖AGP8和糖蛋白EP1等蛋白可能對(duì)體胚發(fā)育早期具有調(diào)控作用;同時(shí)，糖類與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)在龍眼體胚發(fā)生早期的差異性表達(dá)極為顯著，糖酵解、酒精發(fā)酵、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環(huán)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)在球形胚階段基本都表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢，糖類與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)可能參與龍眼體胚發(fā)生早期的調(diào)控。生長素、脫落酸和赤霉素等激素相關(guān)蛋白，脅迫應(yīng)答蛋白CAT、POD、APX、GPX等，脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白在龍眼體胚發(fā)生早期均發(fā)生顯著的差異表達(dá)，可能與龍眼體胚發(fā)生和體胚早期的發(fā)育有著密切的關(guān)系?；趇TRAQ技術(shù)的龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組高能量測序分析，鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)高于之前的研究，也能更精確地獲得不同發(fā)育階段間蛋白質(zhì)的變化，從蛋白質(zhì)水平解析龍眼體胚發(fā)生早期的分子調(diào)控機(jī)制。

3.2? 龍眼體胚發(fā)生全轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Lai等[48]對(duì)龍眼胚性愈傷組織進(jìn)行Solexa測序分析，在龍眼胚性愈傷組織中共有17 306個(gè)基因，共涉及199個(gè)KEGG途徑，其中基因序列長度高于1000 bp的體胚發(fā)生相關(guān)基因有328個(gè)，對(duì)所篩選的23個(gè)基因在體胚發(fā)生過程的表達(dá)分析表明，候選基因在龍眼體胚發(fā)生過程差異表達(dá)，差異表達(dá)基因是龍眼體胚發(fā)生的潛在調(diào)控因子。雖然從龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測序中挖掘了一些體胚發(fā)生相關(guān)基因，但未能闡明體胚發(fā)生過程差異表達(dá)或發(fā)育階段特異表達(dá)基因及其代謝途徑等調(diào)控作用，龍眼體胚發(fā)生過程分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待構(gòu)建。因此，Chen等[49]開展了龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組分析，獲得大量差異表達(dá)基因，初步構(gòu)建了龍眼體胚發(fā)生早期的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò);轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，生長素和細(xì)胞分裂素等激素信號(hào)途徑在龍眼體胚發(fā)生過程的重要調(diào)控作用，類黃酮主要在非胚性愈傷組織中富集，而脂肪酸則主要富集在體胚發(fā)生早期，胚性愈傷組織中表達(dá)最高，隨后略有降低;LTP、CHI、GLP、AGP、EP1等胞外蛋白編碼基因、DNA復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)基因在龍眼體胚發(fā)生早期差異表達(dá)顯著，可能與龍眼體胚發(fā)生具有密切的關(guān)系;將龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組與龍眼9個(gè)組織部位轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)LEC1、L1L、PDF1.3、GH3.6、AGL80、PIN1、BBM、WOX9、WOX2、ABI3、FUS3、LEC2等27個(gè)基因僅在EC、ICpEC、GE階段表達(dá)量極高，在NEC階段表達(dá)量極低或不表達(dá)，可作為龍眼體胚發(fā)生早期的分子標(biāo)記基因;此外，還鑒定了LEA5、CNOT3、DC2.15、PR1-1、NsLTP2等28個(gè)在NEC階段特異表達(dá)的分子標(biāo)記基因，這些發(fā)育階段特異表達(dá)的分子標(biāo)記基因可能是龍眼體胚發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。在龍眼EC和體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，該實(shí)驗(yàn)室還開展了不同光質(zhì)、5-氮胞苷（5-azac）處理的轉(zhuǎn)錄組測序分析。Li等[31]研究了藍(lán)光、白光處理下龍眼胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物積累的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，初步構(gòu)建了影響龍眼功能性代謝產(chǎn)物的藍(lán)光信號(hào)網(wǎng)絡(luò)：在黑暗+藍(lán)光和黑暗+白光中分別鑒定出4463和1639個(gè)差異表達(dá)基因，基于次級(jí)代謝圖譜分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在“莽草酸途徑”“苯丙烷類化合物途徑”“單酚途徑”“木質(zhì)素和木脂素類途徑”“類黃酮途徑”;差異基因成對(duì)比較也說明了藍(lán)光比白光更顯著地影響龍眼EC代謝途徑和其它過程;同時(shí)，PIF4、AFR、MYC2是龍眼EC中受光照影響最為顯著的轉(zhuǎn)錄因子。陳榮珠[50]研究了5-氮胞苷處理的龍眼EC轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得1617個(gè)差異表達(dá)基因，其主要富集在植物病原互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物MAPK信號(hào)通路、淀粉和糖代謝及丁酸鹽代謝等通路;5-氮胞苷處理可降低龍眼的DNA甲基化水平，促進(jìn)龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因的表達(dá)，從而促進(jìn)龍眼早期體胚發(fā)生。

Lin等[51]進(jìn)行了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA組學(xué)分析，鑒定了643個(gè)保守miRNA和29個(gè)新的miRNA，從其中272個(gè)miRNA預(yù)測出2063個(gè)靶基因，龍眼體胚發(fā)生過程qRT-PCR表明dlo- miR156家族及dlo-miR166c*與龍眼體胚早期的發(fā)育關(guān)系密切，dlo-miR26、dlo-miR160a、dlo-miR159等可能參與心形胚和魚雷形胚的形態(tài)建成，dlo-miR4a、dlo-miR24、dlo-miR167a、dlo-miR168a*等小RNA可能參與子葉胚發(fā)育過程的調(diào)控，其中dlo-miR167a、dlo-miR808、dlo-miR5077可能是胚胎成熟所必需的基因。Xu等[52]對(duì)龍眼體胚發(fā)生早期進(jìn)行miRNA測序，從106個(gè)不同的miRNA家族和1087個(gè)新miRNA中共鑒定出289個(gè)已知miRNA，這些已知的miRNA集中在GE階段表達(dá);許多miRNA在EC、ICpEC、GE階段大量且特異性地表達(dá)，一些miRNA及其預(yù)測的靶基因主要富集在木質(zhì)素代謝途徑;通過RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴(kuò)增進(jìn)一步明確了dlo-miR166a- 3p和DlHD-zip8、dlo-miR397a和DlLAC7、dlo-miR408-3p和DlLAC12之間存在相互調(diào)控的關(guān)系。Li等[53]對(duì)不同光質(zhì)處理的龍眼EC進(jìn)行miRNA測序分析，從30個(gè)miRNA家族中鑒定111個(gè)miRNA，miRNA靶基因KEGG富集分析表明，光對(duì)龍眼功能性代謝產(chǎn)物的合成涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種響應(yīng)途徑;此外，miR171D_1、miR394a、miR396b-5p、miR5139可能參與藍(lán)光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物的代謝過程，miR171D_1、miR319e、miR394a、miR395b_2、miR396e可能參與白光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物的代謝過程;miR171f_3、miR390e、miR396b-5p通過分別靶定DELLA、BRI1、EBF1/2與EIN3基因參與藍(lán)光信號(hào)途徑，進(jìn)而調(diào)控龍眼胚性愈傷組織中功能代謝產(chǎn)物的累積。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）參與可變剪切、轉(zhuǎn)錄干擾、DNA甲基化調(diào)控和蛋白修飾等過程，在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀遺傳等水平上發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為探究lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生過程所發(fā)揮的調(diào)控作用，Chen等[54]開展了龍眼體胚發(fā)生早期lncRNA高通量測序分析，共鑒定6005個(gè)表達(dá)的lncRNA，其中4790個(gè)在3個(gè)階段均有表達(dá)，在EC、ICpEC、GE階段特異表達(dá)的lncRNA分別有160、154、376個(gè)，結(jié)合不同階段差異lncRNA成對(duì)比較，說明龍眼GE的形成可能需要大量的lncRNA來啟動(dòng);對(duì)體胚發(fā)生早期表達(dá)的6005個(gè)lncRNA進(jìn)行注釋，1404個(gè)lncRNA屬于506個(gè)非編碼RNA家族、4682個(gè)lncRNA被預(yù)測為靶向蛋白編碼基因，其中靶基因包括順式調(diào)控靶基因5051個(gè)（5712對(duì)），反式調(diào)控靶基因1605個(gè)（3618對(duì)）;KEGG分析發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs的差異表達(dá)靶基因主要參與“植物- 病原體互作”和“植物激素信號(hào)”通路中;在lncRNA-miRNA-mRNA關(guān)系預(yù)測中，40個(gè)lncRNA被預(yù)測為15個(gè)miRNA的內(nèi)源miRNA誘捕靶標(biāo)（eTMs），7個(gè)lncRNA被鑒定為潛在的miRNA前體，并且通過miR172a、miR159a.1和miR398a的瞬時(shí)表達(dá)證實(shí)了lncRNA-miRNA- mRNA之間的調(diào)控關(guān)系;因此，lncRNA作為miRNA的eTMs可能是龍眼早期SE的重要調(diào)控機(jī)制。

3.3? 龍眼體胚發(fā)生過程DNA甲基化研究

植物體胚發(fā)生過程伴隨著DNA甲基化水平的變化，DNA甲基化水平對(duì)植物體胚發(fā)生過程具有重要的調(diào)控作用。研究表明，DNA甲基化水平影響植物的體胚發(fā)生，在柑橘中具體胚發(fā)生能力的愈傷組織比無體胚發(fā)生能力的愈傷組織的DNA甲基化水平更低[55]，刺五加中胚性愈傷組織比非胚性愈傷組織的DNA甲基化水平也更低[56]，蒺藜苜蓿中體胚發(fā)生依賴一定程度的DNA甲基化水平，去甲基化試劑5-氮胞苷處理會(huì)阻止其體細(xì)胞胚的產(chǎn)生從而影響植株的再生能力[57]。近年來，龍眼體胚發(fā)生過程DNA甲基化相關(guān)的研究得到了比較深入的研究。Argonaute蛋白（AGO）是miRNA加工合成途徑中的關(guān)鍵蛋白，參與介導(dǎo)DNA的甲基化過程。楊曼曼[58]從龍眼EC中克隆了AGO家族4個(gè)成員DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6的cDNA全長序列，結(jié)合其在龍眼體胚發(fā)生過程和不同組織部位中的表達(dá)模式分析，初步探究了AGO家族可能參與龍眼體胚發(fā)生過程及其它生長發(fā)育過程的調(diào)控[59-60]。陳榮珠[50]進(jìn)行了龍眼AGO家族的10個(gè)成員的全基因組鑒定，分別分布于第1、4、8、10、12、13、14和15號(hào)染色體，并對(duì)DlAGO4[61]、DlAGO7、DlAGO10[62]和DlAGOMEL1進(jìn)行克隆與表達(dá)模式分析、啟動(dòng)子功能研究，說明其可能參與調(diào)控龍眼體胚發(fā)生過程;此外，5-azac結(jié)合2，4-D處理龍眼EC有利于球形胚的產(chǎn)生，低濃度5-azac處理促進(jìn)DlAGO4的表達(dá)。5-azac處理龍眼EC的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了龍眼DNA甲基化水平的降低促進(jìn)體胚發(fā)生相關(guān)基因和DlAGO4的上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)龍眼體胚發(fā)生。陳曉慧[63]從龍眼EC中克隆lmiRNA介導(dǎo)甲基化通路中的關(guān)鍵因子Dicer-like（DCL）的4個(gè)成員DlDCL1-4及其啟動(dòng)子，實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，一定濃度5-azac處理后DlDCL3和DlDCL4的表達(dá)量下降，而DlDCL1在0.3 μmol/L 5-azac，DlDCL2在0.5 μmol/L 5-azac處理時(shí)表達(dá)量最大，說明DlDCLs不同成員均能響應(yīng)5-azac處理[64-65]。白玉[66]從龍眼EC克隆lmiRNA介導(dǎo)甲基化通路中的關(guān)鍵因子DlDRM1[67]和DlDRM2的克隆與表達(dá)分析，推測龍眼愈傷非胚性與胚性的轉(zhuǎn)化可能與DlDRM1基因的表達(dá)有關(guān)，而DlDRM2在ICpEC中的調(diào)控作用最為顯著，5-azac可能通過促進(jìn)DlDRM1表達(dá)，抑制DlDRM2的表達(dá)，從而參與龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控。

Chen等[68]在龍眼基因組數(shù)據(jù)庫鑒定了龍眼DNA甲基化相關(guān)基因，利用全基因組亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（BS-Seq）繪制龍眼EC、ICpE、GE 3個(gè)階段基因組中單堿基分辨率的胞嘧啶甲基化圖譜，顯示龍眼體胚發(fā)生早期中EC、ICpEC和GE整體5 mC水平分別為24.59%、19.65%和19.74%，表明龍眼體胚早期是一個(gè)DNA甲基化降低的過程，在ICpEC階段DNA甲基化水平最低，隨后在形成GE時(shí)甲基化水平又有所增加，說明細(xì)胞從無組織狀態(tài)的EC轉(zhuǎn)變呈有形態(tài)結(jié)構(gòu)的ICpEC過程中甲基化水平降低;龍眼體胚發(fā)生甲基化程度不同的主要原因是大量CHH位點(diǎn)甲基化的獲得或丟失造成的;對(duì)CHH-DMRs相關(guān)基因GO富集分析表明，DNA甲基化可能在影響體胚發(fā)生過程中的DNA整合、核酸結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮著重要作用;此外，5-azac處理龍眼EC可促進(jìn)其體胚發(fā)生。

3.4? 龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析、全基因組鑒定和功能研究

植物體胚發(fā)生和發(fā)育過程涉及大量特異基因的選擇性表達(dá)[6]。王鳳華等[69]采用DDRT法首次從龍眼體胚中分離獲得5條cDNA片段，實(shí)時(shí)熒光定量分析表明同甜椒和番茄APX同源的基因片段longan1在胚性愈傷組織和球形胚階段特異表達(dá)。隨后，研究人員進(jìn)行了龍眼胚性培養(yǎng)物中體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆及其表達(dá)分析的研究：如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因CDC48[70];Adh、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化相關(guān)基因，SOD家族20個(gè)成員及其中6個(gè)成員的啟動(dòng)子[71]，谷胱甘肽代謝γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST基因[72];胚性相關(guān)基因SERK1、LEC1、AGL15、14-3-3、CHI-I、CHI-III及其啟動(dòng)子[73]，WUS、CLV1、CLV2、CRN[74];激素代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑TIR1、ABP1、ARF1、ACS、ACO、ETR1、ERS基因[75]，ARF家族7個(gè)成員[76]，生長素受體基因TIR1及其啟動(dòng)子[77-78];能量代謝相關(guān)基因ATP β subunit、TPI[43];細(xì)胞程序性死亡相關(guān)基因CP、COX Vb和Caspase[79];WRKY家族10個(gè)成員[80]，NBS- LRR家族46個(gè)成員[81];DlRemorin1-5[82]、DlGRAS4和DlGRAS54[83]等體胚發(fā)生過程差異表達(dá)基因，以及43個(gè)開花時(shí)間相關(guān)基因[47];此外，方智振[44]克隆了Ran家族31條全長cDNA，并研究Ran的3'端轉(zhuǎn)錄多態(tài)性、可變剪接體及其在體胚發(fā)生過程的表達(dá)分析[84-85]，克隆了Ran3A、Ran3B啟動(dòng)子[86];Tian等[87-88]研究了DlRan3A和DlRan3B表達(dá)模式及其啟動(dòng)子的功能;Chen等[89]研究發(fā)現(xiàn)，種子特異表達(dá)基因DlMFT在龍眼體胚發(fā)生和合子胚發(fā)育過程中表達(dá)量顯著上升，可能具有促進(jìn)胚胎發(fā)育的作用，而在種子發(fā)育過程中表達(dá)量顯著下降可能具有抑制種子萌發(fā)的功能。Lin等[90]對(duì)龍眼體胚發(fā)生過程及不同培養(yǎng)條件下多內(nèi)參基因的篩選，為龍眼體胚發(fā)生過程、不同組織部位、外源激素處理等條件下基因的表達(dá)調(diào)控模式分析和基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

自2017年首次完成龍眼全基因組測序[9]以來，龍眼基因家族的全基因組鑒定與表達(dá)分析得到了大量的研究，如ERF基因家族108個(gè)成員[91]、AP2/ERF超家族125個(gè)成員[92]、Sm基因家族29個(gè)成員[93]、Hsf基因家族[94]、GRF基因家族[95]、龍眼HDAC基因家族[96]、BRI家族[97]、漆酶家族成員[98]、Aquaporin基因家族[99]、纖維素合成酶CESA基因家族[100]、SDG基因家族[101]、RNA甲基化相關(guān)基因[102]、類受體蛋白激酶CRK家族[103]、MSIL基因家族[104]、4CL基因家族[105]、HD-Zip基因家族[106]等。基于龍眼基因組數(shù)據(jù)庫，龍眼基因家族成員的鑒定及其表達(dá)分析得到了廣泛的研究，完善了龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

林玉玲[107]研究了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在體胚發(fā)生過程差異表達(dá)的miRNA可能通過與靶基因SOD家族的調(diào)控作用，從而影響龍眼體胚發(fā)生過程。Lin等[108]進(jìn)行了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA內(nèi)參基因的篩選，為龍眼體胚發(fā)生過程miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其功能研究奠定基礎(chǔ)。王亞婷[109]克隆dlo- miR156a-1、dlo-miR156a-2、dlo-miR166a、dlo- miR397a初級(jí)體及其靶基因laccase、β-tubulin，分析dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因β-tubulin表達(dá)模式。林麗霞[76]研究表明dlo-miR160負(fù)調(diào)控ARF10、ARF16、ARF17，dlo-miR167負(fù)調(diào)控ARF6和ARF8，dlo-miR390負(fù)調(diào)控TAS3，TAS3負(fù)調(diào)控ARF3、ARF4。Lin等[110]研究表明dlo-miR160a、dlo-miR160a、dlo-miR160d分別在魚雷型胚、球形胚和子葉形胚階段表達(dá)量出現(xiàn)峰值，可能對(duì)龍眼體胚發(fā)生中期和晚期階段具有調(diào)控作用;eTM-miR160-ARF10/16/17在體胚發(fā)生過程中起潛在調(diào)控作用，所鑒定的4個(gè)miR160的eTM，有2個(gè)對(duì)miR160a與靶基因的結(jié)合可能具有破壞作用，并參與生長素和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Lin等[111]研究了eTM-miR167- ARF6/8在龍眼體胚發(fā)生過程的功能，所鑒定的2個(gè)miR167的eTM在球形胚階段表達(dá)量最大，但在不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)和魚雷型胚階段幾乎不表達(dá);龍眼體胚發(fā)生后期，eTM可能通過裂解靶基因ARF8從而對(duì)dlo-miR167的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。TIR1與dlo-miR393互作關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，dlo- miR393可能通過抑制TIR1-3的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響龍眼體胚發(fā)生過程[78]。同時(shí)，研究人員對(duì)龍眼microRNA分子特性及其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，如miR403[112]、miR395[113]、miR166家族成員[114]、miR397家族成員[115]、miR159家族成員[116]、miR171家族成員[117]、miR172家族成員[118]等;張清林等[119]克隆了龍眼體胚發(fā)生早期miR166的初級(jí)體并進(jìn)行表達(dá)分析;蘇立遙等研究了miR403及其候選靶標(biāo)對(duì)外源激素的響應(yīng)模式以及在龍眼體胚中的表達(dá)模式[120]、eTM和microRNA319及其調(diào)控靶標(biāo)在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)模式[121]。此外，Zhang等[122]研究了龍眼miR166的結(jié)構(gòu)和龍眼體胚發(fā)生過程的表達(dá)模式及功能，發(fā)現(xiàn)miR166與ATHB15在龍眼體胚發(fā)生早期呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，高水平表達(dá)miR166a.2可能有利于維持疏松的龍眼愈傷組織，而高水平表達(dá)ATHB15有利于球形胚的形成。

李漢生[123]在龍眼EC過表達(dá)和抑制表達(dá)miR390e，發(fā)現(xiàn)miR390e能夠剪切DlBRI1-3從而抑制DlBRI1-3的轉(zhuǎn)錄，影響龍眼功能性代謝產(chǎn)物的合成。陳裕坤[47]將DlMFT、DlTFL1、DlSHR異源表達(dá)于本氏煙，發(fā)現(xiàn)龍眼DlMFT能抑制種子的萌發(fā)但不影響植物的開花時(shí)間，龍眼DlTFL1具有調(diào)控植物開花時(shí)間的功能;DlSHR不僅影響轉(zhuǎn)基因植株的根系輻射狀分布，還會(huì)影響植物的生長發(fā)育過程，如出現(xiàn)生長較慢、開花推遲、根少且粗大、根光滑幾乎無毛、葉和莖部出現(xiàn)一定程度的扭曲、葉表皮毛粗大等表型;qRT-PCR表明過表達(dá)DlSHR植株中根輻射狀基因SCR及赤霉素相關(guān)的GAI基因表達(dá)極顯著增加，DlSHR可能通過控制SCR和GAI等下游基因的表達(dá)影響根系的結(jié)構(gòu)及葉片形態(tài)。

4? 龍眼胚性愈傷組織受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化研究

龍眼遺傳轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)開展了近20年，但相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。陳裕坤等[124]和田奇琳[125]采用根癌農(nóng)桿菌侵染龍眼實(shí)生幼苗去頂和去頂芽部位獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。但是，以龍眼胚性愈傷組織為受體材料的轉(zhuǎn)基因研究目前還未能成功獲得完整的轉(zhuǎn)基因龍眼植株;曾黎輝[126]利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染龍眼1月齡成熟胚和無菌初生苗，誘導(dǎo)出毛狀根后再培養(yǎng)得到3株轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)基因植株的表型出現(xiàn)異常。通過組織、細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，龍眼胚性愈傷組織的體胚發(fā)生主要為單細(xì)胞內(nèi)起源，這可能造成外源基因轉(zhuǎn)化至胚性細(xì)胞中的效率較低[22]。因此，很有必要對(duì)龍眼體胚不同發(fā)育階段的受體材料進(jìn)行篩選，并對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化。賴鐘雄[127]采用基因槍轉(zhuǎn)化法將PBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至龍眼胚性細(xì)胞中，獲得Kan抗性細(xì)胞，經(jīng)GUS檢測表明gus基因已經(jīng)整合至龍眼胚性愈傷組織中，抗性細(xì)胞接種至分化培養(yǎng)基中獲得了胚狀體。張妙霞[128]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PEAS基因?qū)臊堁叟咝杂鷤M織中，獲得5個(gè)龍眼抗性細(xì)胞系。鄭啟發(fā)等[129]用金剛沙對(duì)液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷組織進(jìn)行創(chuàng)傷，結(jié)合根癌農(nóng)桿菌侵染法，將含有AP1和POD基因的質(zhì)粒導(dǎo)入懸浮培養(yǎng)系細(xì)胞中，最終獲得轉(zhuǎn)化AP1和POD基因的陽性龍眼胚狀體。徐清鋒[130]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ACS反義基因轉(zhuǎn)化龍眼胚性愈傷組織，經(jīng)GUS染色及PCR檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織。曾麗蘭[131]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將龍眼FSD-pro4轉(zhuǎn)化至龍眼胚性愈傷組織中，經(jīng)過抗性篩選及PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織。張冬敏[132]利用根癌農(nóng)桿菌侵染法，將DlWUS瞬時(shí)過表達(dá)于龍眼EC，并初步驗(yàn)證了龍眼EC過表達(dá)DlWUS抑制DlCLV1、DlCLV2、DlCRN的表達(dá)。賴瑞聯(lián)[133]借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑成功將miR393- agomir及其高效阻斷劑miR393-antagomir轉(zhuǎn)化至龍眼胚性愈傷組織中，初步建立了外源miRNA轉(zhuǎn)化龍眼胚性愈傷組織的高效體系。因此，已初步建立起以龍眼胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法，但其轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的體胚發(fā)生和植株再生能力等還存在一定的問題，今后在轉(zhuǎn)基因方法和轉(zhuǎn)基因體系優(yōu)化方面還有待深入研究。

5? 展望

龍眼體胚發(fā)生不僅是植株體外再生的重要途徑之一，還是研究龍眼分子生物學(xué)的優(yōu)良體系，為龍眼分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)和提供良好平臺(tái)。龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化變化進(jìn)一步明確了內(nèi)源激素代謝與動(dòng)態(tài)平衡對(duì)龍眼體胚發(fā)生具有重要的作用;研究結(jié)果已經(jīng)表明，不同的培養(yǎng)基成分、不同光質(zhì)、不同外源添加物和不同培養(yǎng)階段影響龍眼體胚中功能性代謝物的積累，借助生物反應(yīng)器初步建立了龍眼胚性細(xì)胞的大量培養(yǎng)，將來可應(yīng)用于龍眼功能性代謝物如龍眼多糖、類黃酮、生物堿等的規(guī)模生產(chǎn)。龍眼體胚發(fā)生早期和中期的蛋白質(zhì)組學(xué)、全轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DNA甲基化研究，挖掘了大量體胚發(fā)生過程差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和基因，從mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)和DNA甲基化水平分析了龍眼體胚發(fā)生的分子機(jī)制;破譯龍眼基因組為龍眼體胚發(fā)生的分子機(jī)制研究搭建了重要的基因組信息平臺(tái)，體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、基因家族的全基因組鑒定與表達(dá)分析，進(jìn)一步豐富了龍眼體胚發(fā)生的分子機(jī)制。但龍眼體胚發(fā)生中期至體胚成熟期的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待完善，龍眼體胚發(fā)生的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待于進(jìn)一步解析，龍眼體胚發(fā)生過程的代謝組學(xué)、cirRNA、單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序和染色體外環(huán)狀DNA（eccDNA）等研究還有待開展（單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序等部分工作正在進(jìn)行中）。龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因的功能研究目前還比較依賴于異源表達(dá)模式植物，在龍眼胚性愈傷組織上的轉(zhuǎn)化以瞬時(shí)表達(dá)為主，將來可通過優(yōu)化龍眼體胚轉(zhuǎn)化方法，將龍眼體胚發(fā)生過程顯著差異表達(dá)或階段特異性表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化至胚性愈傷組織中，獲得過表達(dá)與突變體細(xì)胞系或株系，可進(jìn)一步揭示體胚發(fā)生關(guān)鍵基因在龍眼體胚發(fā)生過程的功能及其調(diào)控機(jī)制。最近，我們實(shí)驗(yàn)室采用PacBio Sequel又完成了‘紅核子龍眼基因組三代測序（待發(fā)表），基因組序列原始草圖長度0.49 Gb，初步組裝的ContigN50達(dá)到5.71 Mb，共327條Contigs。利用Hi-C技術(shù)進(jìn)一步輔助基因組組裝至染色體水平，通過對(duì)Contigs進(jìn)行排序，最終構(gòu)建成15條Superscaffolds（包含300條Contigs），總長0.45 Gbp，Contigs N50為4.4 Mb，Superscaffold N50為27.7 Mb，占原始基因組長度的91.69%;隨后對(duì)其全基因組構(gòu)建互作圖譜，符合互作規(guī)律，表明該物種Hi-C輔助組裝結(jié)果良好。同時(shí)，進(jìn)一步利用Hi-C技術(shù)研究龍眼體胚發(fā)生早期染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在胚性愈傷組織（EC）分化發(fā)育成球形胚（GE）過程中，其三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了大規(guī)模重組;從EC分化到不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）過程，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加致密，B Compartment之間的互作增強(qiáng)，同時(shí)該區(qū)域的開放性增強(qiáng)，A Compartment染色質(zhì)間互作減弱。龍眼基因組三代測序提供了更加完整和全面的基因組信息，為進(jìn)一步揭示龍眼體胚發(fā)生的分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，特別是龍眼體胚發(fā)生過程的Hi-C測序，揭示了龍眼體胚發(fā)生過程的基因組動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì)于揭示植物早期體胚發(fā)生的分子機(jī)制，提供了新的線索。

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