渥丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究

李艷敏　張晶　王朝陽　徐夢嵐　蔣卉　符真珠　張和臣

摘要：為了保護渥丹野生資源，加快其繁殖速度，開展以渥丹鱗莖為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)研究，篩選不定芽誘導、增殖及生根的最佳培養(yǎng)基，并進行移栽試驗。結(jié)果表明，渥丹鱗莖的中部鱗莖片適宜不定芽誘導，采用先預處理鱗莖再整體滅菌的方法，中部鱗片的污染率為10.0%，誘導和增殖培養(yǎng)基均為MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導率為100%，增殖系數(shù)為2.78;渥丹試管苗誘導生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，生根率為100.0%，平均根數(shù)4.1條，平均根長為3.69 cm，同時該處理的生根試管苗移栽成活率為100.0%。

關(guān)鍵詞：渥丹;鱗莖;增殖;生根;移栽

中圖分類號：S682.2+65.04+3 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0052-04

收稿日期：2020-05-12

基金項目：河南省科技攻關(guān)計劃（編號：192102110148）。

作者簡介：李艷敏（1978—），女，河南湯陰人，碩士，副研究員，主要從事園林植物組培快繁技術(shù)研究。E-mail：minzili@126.com。

通信作者：張和臣，博士，副研究員，主要從事園林植物遺傳育種及分子生物學相關(guān)研究。E-mail：zhc5128@126.com。

渥丹是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物，產(chǎn)于河南、河北、山東、山西、陜西和吉林，花深紅色，有香味，可觀賞，亦可提取芳香油作香料;鱗莖含淀粉，可食用或釀酒，也可入藥，具有滋補強壯、止咳之功效[1]。渥丹是紅花百合育種的重要親本材料[2]，也是百合科生物多樣性重要資源，具有良好的發(fā)展和應用前景。為了保護渥丹種質(zhì)資源，同時又能夠開發(fā)利用這一重要資源，開展了其繁殖技術(shù)研究。目前關(guān)于渥丹的研究主要有不同居群形態(tài)多樣性、核型和花粉多樣性等[2-4]，其繁殖以扦插為主[5]，關(guān)于渥丹的離體培養(yǎng)技術(shù)研究報道很少[6-7]，研究者主要篩選了不同部位鱗片滅菌的適宜時間和培養(yǎng)基對增殖培養(yǎng)的影響，缺少對生根培養(yǎng)及移栽的系統(tǒng)研究，研究中存在外植體污染率高的問題，以中部鱗片為外植體，污染率為595%[6]。因此，本研究選擇渥丹地下鱗莖為外植體，采用先對鱗莖進行預處理再將鱗莖整體滅菌的方式進行消毒，降低渥丹外部和中部鱗片的污染率，同時對影響生根的激素種類和濃度進行篩選，并研究活性炭對渥丹試管苗生根的影響，對不同來源的生根苗分別進行移栽，根據(jù)試管苗生根率和移栽成活率確定最佳的生根培養(yǎng)基，完善其組織培養(yǎng)技術(shù)，為渥丹的綜合利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年在河南省南陽市寶天曼山中發(fā)現(xiàn)渥丹野生植株，取1株苗帶回鄭州，于2018年5月至2019年5月在河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所園藝植物組織培養(yǎng)室，開展其組織培養(yǎng)技術(shù)研究。

1.2 方法

將取下的小鱗莖用自來水沖洗干凈，用洗潔精、多菌靈和羧芐溶液進行預處理，然后拿到超凈工作臺上進一步消毒滅菌，具體方法是用75%乙醇滅菌30 s，然后用0.1% HgCl2滅菌8 min，用無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgCl2滅菌8 min，無菌水沖洗3遍，然后進行接種。接種時，將鱗莖按照從外到內(nèi)的包裹順序分別切割，分為外部鱗片（W）、中間鱗片（Z）和內(nèi)部鱗片（N） 3種，觀察這3種外植體的污染情況、誘導出芽情況以及誘導出不定芽數(shù)量。

渥丹鱗片誘導不定芽的培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有BA、KT以及NAA，具體的使用濃度及配比見表1。以中部鱗片為研究材料，觀察不同誘導培養(yǎng)基對不定芽誘導率及不定芽個數(shù)的影響。

將誘導出來的不定芽在MS+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3代， 然后獲得足夠多的生長一致的無菌苗后，進行增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1.0 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，KT的濃度分別為0、0.1、0.5、10 mg/L，觀察不定芽的增殖情況;生根培養(yǎng)基同樣以MS為基本培養(yǎng)基，其中大量元素減半，附加的激素種類及濃度見表2。

以上培養(yǎng)均以30 d為周期，增殖和生根培養(yǎng)時，每個處理接種9瓶，每瓶4株苗，重復3次。培養(yǎng)條件為（25±2） ℃，光照度2 000 lx，光照周期為12 h/d。

將不同生根誘導培養(yǎng)基來源的渥丹生根苗分別進行移栽，移栽基質(zhì)均為珍珠巖與草炭（1 ∶1）的混合基質(zhì)，栽后放在育苗室，溫度為（23±2） ℃，并蓋膜保濕，移栽1周后通風，移栽1個月后統(tǒng)計各處理生根苗的移栽成活情況。

增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)以及移栽均采用單因素完全隨機設(shè)計，所得數(shù)據(jù)用DPS 6.55軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位鱗片消毒及出芽效果

渥丹不同部位鱗片，其消毒效果也不相同。從表3中可以看出，外部鱗片（W）的污染率最低，為0，其次是中部鱗片（Z），污染率為10.0%，內(nèi)部鱗片（N）出現(xiàn)都是白色的細菌污染，污染率最高，為385%，應該是由于鱗片在內(nèi)部，滅菌液無法充分對其消毒造成，因此選擇中外部鱗片作為外植體，污染率低。

不同部位鱗片誘導出芽的能力有差別，從表3中可以看出，W的誘導率僅7.1%，而Z和N的誘導率分別為70.0%、69.2%，是W誘導率的10倍左右，說明Z和N作為渥丹外植體，誘導效率最好。結(jié)合污染率和誘導率，中部鱗片適宜作為渥丹組織培養(yǎng)的外植體。

2.2 不同培養(yǎng)基對中部鱗片誘導效果的影響

將中部鱗片接種到不同的誘導培養(yǎng)基上，觀察誘導培養(yǎng)基對其不定芽誘導的影響。從表4可以看出，在培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基5中，鱗片的誘導率均為100%，誘導出來的不定芽數(shù)量分別為2、4個，其他3種培養(yǎng)基誘導率均為50%，誘導出來的不定芽均為1個，說明培養(yǎng)基2和5適合中部鱗片不定芽誘導，以培養(yǎng)基5最為合適，即0.1 mg/L KT+10 mg/L NAA的組合能夠用于鱗片不定芽誘導。

2.3 增殖培養(yǎng)基篩選

從表5以看出，僅添加1.0 mg/L NAA的對照，其增殖系數(shù)為2.28，苗鱗莖片大，葉片多，同時伴有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。添加不同濃度的KT后，試管苗的增殖系數(shù)和生長狀況有不同變化，添加0.1 mg/L KT的B1處理，其增殖系數(shù)為2.78，與對照差異不顯著，但試管苗分化的鱗莖多，有生根現(xiàn)象;當KT濃度進一步增加到0.5 mg/L（B2處理）和 1.0 mg/L（B3處理）時，增殖系數(shù)開始下降，其中B2處理增殖系數(shù)為1.97，與CK、B1處理差異不顯著，B3處理增殖系數(shù)為1.55，顯著低于B1處理，但是與CK和B2處理差異不顯著，并且渥丹試管苗鱗莖片大，葉片少，生長勢弱。因此，渥丹增殖的適宜培養(yǎng)基為MS附加1.0 mg/L NAA和0.1 mg/L KT。

2.4 不同生根培養(yǎng)基對渥丹試管苗生根及移栽的影響

從表6可以看出，渥丹試管苗在不添加激素的空白培養(yǎng)基中，可以達到100.0%的生根率，但是平均根數(shù)少，僅2.9條;添加不同濃度和種類的生長素以及AC后，生根率和平均根數(shù)及平均根長均呈現(xiàn)不同的變化。單添加不同濃度的NAA（處理號T1～T3）后，與對照相比，生根率和平均根長顯著下降，但是T1和T2處理的平均根數(shù)顯著增加，以T2處理的平均根數(shù)最多，為5.0條;將NAA和AC配合使用（處理號T4～T5）時，生根率和對照相比差異不顯著，但是平均根數(shù)顯著高于對照，并且T5處理的生根率為100.0%，平均根數(shù)為4.1條，平均根長 3.69 cm，顯著高于對照;將NAA和IBA配合使用（處理號T6～T7時），T7處理的生根率與對照無差異，平均根數(shù)顯著高于對照，但是平均根長顯著低于對照。因此，與對照相比，添加適宜濃度的NAA和IBA后，可以促進渥丹試管苗平均根數(shù)的增加，但是會抑制根長生長;添加適宜濃度的AC后，可以促進渥丹試管苗平均根數(shù)和平均根長，提高生根苗質(zhì)量。

將不同來源的渥丹生根試管苗經(jīng)過相同的煉苗方式，移栽到相同基質(zhì)后，移栽成活率可以達到89.4%及以上，不同處理的植株移栽成活率稍有差異，來源于T5的生根苗，移栽成活率最高，為1000%，與CK差異不顯著;在移栽苗生長勢方面，來源于CK、T1、T4、T5處理的植株挺立，生長勢良好，這些處理的試管苗平均根長均在1.0 cm以上，來源于T2、T3、T6處理的植株生長勢弱，植株不挺立，這3個處理的試管苗平均根長均低于1 cm，說明平均根長對試管苗移栽后的生長影響較大。

綜上，渥丹試管苗在T5處理中生根率和生根質(zhì)量最好，并且移栽成活率也最高，為渥丹試管苗的最佳生根培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

外植體滅菌技術(shù)是植物組織培養(yǎng)研究中的一項重要內(nèi)容，鱗莖由于生長在土壤中，帶菌較多，滅菌較困難，污染率較高[8]，在以往的渥丹離體培養(yǎng)報道中，對鱗莖的滅菌方式是沖洗鱗莖，剝下鱗片，按不同部位進行洗潔精刷洗，流水沖洗，再用0.1% HgCl2溶液2次滅菌，污染率得到了良好的控制，但是對外部鱗片和中部鱗片而言，污染率依然分別在43.33%、28.33%以上[2]。在本研究中，對渥丹地下鱗莖的滅菌方法進行了改良，首先在預處理環(huán)節(jié)，對鱗莖進行整體處理，并采用頭孢和羧芐溶液初步消毒，然后再在超凈臺上用75%乙醇和0.1% HgCl2進行消毒，無菌水沖洗結(jié)束后，再開始剝下鱗片接種。采用此方法滅菌，有效地降低了污染率，尤其降低了外部鱗片和中部鱗片的污染率，但是由于鱗莖整體滅菌，滅菌液不能很好地滲透到內(nèi)部鱗片，出現(xiàn)內(nèi)部鱗片滅菌不徹底，均為細菌污染，污染率高。不同部位的鱗片，其誘導率有差異，誘導能力從強到弱依次為中部鱗片>內(nèi)部鱗片>外部鱗片，這與趙靜等的研究結(jié)果[9]一致，與楊偉茹等的研究結(jié)果[6，10]不一致，這可能與滅菌方式不同有關(guān)。魯潤龍以百合鱗片進行組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，芽原基來源于鱗片表皮細胞及其鄰近皮層細胞分裂加快，撕去表皮細胞時，則無法形成芽原基，不能形成鱗莖[11]。在本研究中，外部鱗片的誘導率很低，可能是因為外部鱗片與滅菌液接觸時間長，滅菌液對鱗片表皮損傷嚴重，從而降低了其誘導分化能力。

植物生長調(diào)節(jié)劑在試管苗不定根形成過程中起決定性作用，適宜濃度的生長調(diào)節(jié)劑不僅有利于誘導根原基，還有利于不定根的生長，但過高濃度的生長調(diào)節(jié)劑會抑制根原基的生長，進而影響根伸長[12]。在百合的組織培養(yǎng)研究中，藥用百合生根時，幼苗生根時采用1/2MS附加NAA時，誘導出的根短且粗壯，有根毛，移栽易成活[13];南川百合無根苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA，生根率為86.7%[9];野百合試管苗以不加任何激素的1/2MS生根最好，添加0.2 mg/L NAA時對生根有抑制作用[14];活性炭具有吸附作用，同時能夠提供一種黑暗環(huán)境，有利于植物生根[15]，百合生根時培養(yǎng)基中添加活性炭后生根時間早，不定根濃密粗壯[12]。本研究結(jié)果表明，渥丹試管苗生根培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中添加0.1～0.5 mg/L生長素可以提高生根數(shù)量，NAA的濃度達到1.0 mg/L時，生根率、平均根數(shù)和平均根長都顯著降低;將NAA和IBA配合使用，對試管苗生根率和根數(shù)有促進，但是顯著抑制根生長。在不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中，生根率可以達到100.0%，但是生根質(zhì)量一般，主要表現(xiàn)在根數(shù)和根長方面，平均根數(shù)為2.9條，平均根長為2.26 cm;在生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA和10 g/L AC的T5處理中，生根率為100.0%，平均根數(shù)為4.1條，平均根長為3.69 cm，顯著高于對照處理，并且在對生根試管苗進行移栽后發(fā)現(xiàn)，T5處理的移栽成活率為100.0%，對照處理的移栽成活率為98.5%，說明活性炭可以促進渥丹試管苗生根，提高生根率和生根質(zhì)量，有利于移栽，這與張俊秀的研究結(jié)果[12]一致。

綜上，以渥丹鱗莖為外植體進行組織培養(yǎng)，采用預處理后再將鱗莖整體消毒的方法，可以降低污染率，中部鱗莖片適宜不定芽誘導，誘導和增殖培養(yǎng)基均為MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導率為100%，增殖系數(shù)為2.78;渥丹試管苗誘導生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，生根率為100.0%，平均根數(shù)4.1條，平均根長為3.69 cm，同時該處理的生根試管苗移栽，其成活率為100.0%。

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