上海地區(qū)犬細(xì)小病毒病流行情況調(diào)查與病毒的分離鑒定

沈海瀟, 李鑫，楊德全，鞠厚斌，劉健，龔國華，趙洪進(jìn)

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，是危害犬類的最主要的烈性傳染病之一，從發(fā)現(xiàn)至今已在世界各地均有流行。該病毒傳播速度快、對幼犬有很高的致病性和致死率，給世界養(yǎng)犬業(yè)帶來巨大的災(zāi)難。CPV 可感染犬科動物包括犬、貓和其他易感動物，且具有發(fā)病急、病程短、傳染性強、死亡率高的特點。CPV-2存在3種亞型，即 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，近些年來又進(jìn)化為 new CPV-2a、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)[1-2]。雖然犬細(xì)小病毒是DNA病毒，但卻有著與 RNA 病毒類似的高突變率，值得引起我們的重視。

犬細(xì)小病毒病發(fā)病具有明顯的季節(jié)性，即冬季高發(fā)，夏季發(fā)病較少，其原因可能是寒冷季節(jié)導(dǎo)致犬的抵抗力下降，發(fā)病率明顯增加[4-5]。CPV所致的臨床癥狀表現(xiàn)取決于病毒的毒力、感染程度和宿主抵抗力，按臨床癥狀可分為腸炎型和心肌炎型[6]。本病最初 24～48 h內(nèi)一般不出現(xiàn)腹瀉，若發(fā)生腹瀉也很少出現(xiàn)便血。炎癥會繼發(fā)腸道蛋白質(zhì)減少，造成低蛋白血癥。嘔吐是常見癥狀，嚴(yán)重時可引起食管炎，還會引起骨髓干細(xì)胞破壞，導(dǎo)致暫時性或長期性中性粒細(xì)胞減少，使動物發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)菌感染，尤其是腸道損傷使得細(xì)菌易于進(jìn)入機(jī)體。病情嚴(yán)重的犬可見體溫升高、全身炎性反應(yīng)綜合征。幼犬可經(jīng)子宮感染本病，在 8 周齡前的幼犬常常表現(xiàn)為心肌炎[7-10]。

本研究初步調(diào)查了2019年上海地區(qū)家養(yǎng)犬及流浪犬CPV感染的流行情況并對流行毒株進(jìn)行分離培養(yǎng)、進(jìn)化分析、以及形態(tài)學(xué)鑒定，以闡明上海地區(qū)CPV感染的流行率，病原遺傳變異及分子特征等，為該病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理

定期收集來自上海犬類留驗場以及各寵物免疫點犬的糞便。采集的新鮮糞便樣本第一時間送回實驗室處理。

處理過程：取陽性病料0.5 g，用DMEM細(xì)胞營養(yǎng)液10倍稀釋，振蕩器充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，4 ℃保存?zhèn)溆没?80 ℃保存。

1.2 細(xì)胞系

貓腎傳代細(xì)胞(F81)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；細(xì)胞按常規(guī)消化傳代，37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；MagPure Viral RNA Kit購自Magen公司；DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；犬細(xì)小病毒熒光定量試劑盒購自書扁科技有限公司；PEG 8000購自Scientan公司。

1.4 犬細(xì)小病毒的檢測

1.4.1 核酸提取

取0.25 g的糞便樣品加入含1 mL PBS的EP管中，溶解混勻后，按MagPure Viral RNA Kit說明書進(jìn)行核酸提取。

1.4.2 熒光定量PCR

根據(jù)犬細(xì)小病毒熒光PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，對于每一個反應(yīng)體系：PCR預(yù)混液20 μL，Taq酶0.25 μL，DNA 5 μL。程序設(shè)置如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s(收集熒光)，40個循環(huán)。

1.5 病毒的分離與鑒定

1.5.1 病毒的分離

取陽性病料0.5 g，用DMEM細(xì)胞營養(yǎng)液10倍稀釋，振蕩器充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，置-30 ℃凍存?zhèn)溆?。選擇剛剛長滿單層的F81細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，用PBS浸洗，加入600 μL病毒懸液，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中吸附 60 min，之后取出培養(yǎng)瓶，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，然后加入 10 mL 含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，每日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)是否出現(xiàn)細(xì)胞病變；對不同代次培養(yǎng)物進(jìn)行熒光定量PCR檢測，連續(xù)3代未檢出陽性且沒有細(xì)胞病變者，判為陰性。將接毒細(xì)胞液置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.5.2 病毒的鑒定

將分離到的病毒使用PEG 8000進(jìn)行濃縮后，在透射電鏡下進(jìn)行病毒形態(tài)的觀察。

1.6 基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的犬細(xì)小病毒VP2基因序列，進(jìn)行引物的設(shè)計及合成，提取病毒基因，具體步驟按照說明書進(jìn)行。得到片段大小相符的PCR產(chǎn)物送桑尼生物有限公司測序。

1.7 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹

借助MEGA6軟件，確定這4株犬細(xì)小病毒VP2基因的遺傳分類情況。參考菌株信息見表1。

表1 參考毒株背景信息

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 上海地區(qū)犬細(xì)小病毒病流行情況

對上海地區(qū)犬類留驗場、養(yǎng)殖場以及各免疫點采取定期的集中監(jiān)測，共采集糞便樣品796份，陽性率為30.65%。其中，流浪犬的糞便樣品675份，陽性率為34.52%；家養(yǎng)犬的糞便樣品121份，陽性率為9.10%。不同月份的犬細(xì)小抗原陽性率見圖1。

圖1 上海地區(qū)犬細(xì)小病毒病流行情況

2.2 病毒分離和細(xì)胞病變

將檢測陽性的犬糞便樣品處理后，接種F81細(xì)胞，其中4個組在接毒細(xì)胞的前2代沒有出現(xiàn)明顯病變，但是經(jīng)過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Ct值明顯下降，傳至第3代細(xì)胞出現(xiàn)脫落、崩解和破碎及腫脹圓縮、拉網(wǎng)等細(xì)小病毒特有的細(xì)胞病變(CPE)。在細(xì)胞培養(yǎng)96 h時出現(xiàn)明顯的CPE，陰性對照未出現(xiàn)CPE(圖2)。選擇其中一株繼續(xù)傳代，傳至第17代后測定其滴濃度為107.0TCID50/mL。

圖2 CPV在F81細(xì)胞中產(chǎn)生的CPE(200×)

2.3 病毒形態(tài)

在電子顯微鏡下觀察，病毒呈現(xiàn)二十面體立體對稱，無囊膜，直徑為20 nm左右的典型細(xì)小病毒樣粒子(圖3)。

2.4 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹以及氨基酸序列分析比較

將CPV/CHINA/SH-1進(jìn)行了全基因測序， GenBank登錄號為：MN840830。使用MEGA6對分離到4株CPV VP2基因進(jìn)行遺傳演化分析(圖4),表明分離到的毒株既有2c型，也存在2b型。通過分析可以看出，本次分離到的毒株與同一亞型的在我國分離到的毒株親源關(guān)系較近。此外，在2c亞型中，我國國內(nèi)分離的CPV-2c已經(jīng)與國外分離得到的CPV-2c形成了明顯的兩個分支，說明我國的CPV在進(jìn)化過程中呈現(xiàn)出一定的地域特性。另外，從結(jié)果上看犬細(xì)小病毒的疫苗株與本次分離到的毒株親緣性較遠(yuǎn)，提示現(xiàn)有疫苗對目前所流行的犬細(xì)小病毒的保護(hù)效果需要進(jìn)行新的評估。

圖3 分離到的CPV電鏡形態(tài)學(xué)觀察

● 本研究中得到的分離株

3 討論

犬細(xì)小病毒病是臨床上最常見的犬類疾病之一，我國曾經(jīng)主要流行的是CPV-2a亞型[11]，但在2010年以后，開始陸續(xù)報道CPV-2c的出現(xiàn)[12]。目前世界各地許多地區(qū)均報道了CPV-2c的出現(xiàn)，韓國也于最近首次報道了感染CPV-2c的病例[13]。這說明犬細(xì)小病毒不僅在持續(xù)變異，同時還以很快的速度傳播，并具有跨區(qū)傳播的能力。在臨床上普遍認(rèn)可的治療方法是對癥治療，在最近的幾項臨床研究中發(fā)現(xiàn)，用重組貓干擾素治療，可以降低死亡率，更快地改善臨床癥狀[14]。而在預(yù)防方面，CPV由于可以在環(huán)境中長期存在，且能夠在很長的一段時間內(nèi)保持感染性[15]，因此定期的疫苗接種格外重要?，F(xiàn)有的針對CPV的疫苗類型有弱毒苗、亞單位疫苗、滅活苗以及核酸疫苗。市面上流行的CPV疫苗以弱毒苗為主，其在防控犬細(xì)小病毒病的過程中起到了重要的作用。只是目前在全世界范圍內(nèi)，對于疫苗的接種還并未有一個明確、科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，而幼犬由于受母源抗體的干擾，在疫苗接種的時間上也存在爭議。研究表明，幼犬在初次免疫后隔5周或6周應(yīng)當(dāng)重新接種一次疫苗，其原因是，加強免疫有助于高水平抗體保持較長時間并減少母源抗體的干擾，從而起到較好的保護(hù)效果[16]；而成年犬則至少應(yīng)該每3年接種一次疫苗[17]。

在CPV的持續(xù)變異的壓力下，對區(qū)域內(nèi)犬細(xì)小病毒的持續(xù)監(jiān)測，仍是第一時間對其進(jìn)行有效防控的前提。本研究對2019年上海地區(qū)犬類留驗場以及各寵物免疫點進(jìn)行了CPV的定期集中監(jiān)測，結(jié)果表明，CPV在流浪犬中的陽性率明顯高于家養(yǎng)犬(分別為34.52%和9.10%)，此外不同月份CPV的陽性率也存在一定差異，這提示我們，氣候、溫度等環(huán)境因素也是防控過程中需要注意的。

對陽性糞便樣品進(jìn)行了CPV的分離，成功獲得4株CPV毒株，隨后對4株毒株的VP2基因進(jìn)行測序，并繪制基因進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，本次分離到的犬細(xì)小病毒中，1株屬于CPV-2c型，其余3株屬于CPV-2b型，而且CPV的疫苗株與本次分離到的毒株親緣性較遠(yuǎn)，提示現(xiàn)有疫苗對上海地區(qū)所流行的CPV的保護(hù)效果需要進(jìn)行重新評估。

本次研究結(jié)果提示，上海地區(qū)CPV呈現(xiàn)出多亞型的混合流行，并且在長期進(jìn)化和免疫壓力下正在發(fā)生持續(xù)的變異，從而導(dǎo)致了防控難度進(jìn)一步加大，這可能也是目前臨床上CPV感染病例逐漸增多和免疫犬發(fā)病的重要原因之一[18]。對CPV的長期持續(xù)監(jiān)測，不僅能夠第一時間了解目前上海地區(qū)CPV的流行與變異情況，還能夠以此來實時調(diào)整防控手段，改進(jìn)防控技術(shù)，對上海地區(qū)養(yǎng)犬業(yè)有著重大意義。