王朋濤,梁秀麗,徐盟龍,趙福杰,閆曉光,魏戰(zhàn)勇, 3*
(1. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002;2. 安陽工學院,河南 安陽 455000;3. 河南省動物性食品安全重點實驗室,河南 鄭州 450002)
干擾素(interferon, IFN)是一類具有抗病毒、抑制細胞增殖等多功能糖蛋白,在適應性免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用[1]。干擾素在病原入侵機體時誘導相關抗病毒蛋白的表達,例如:蛋白激酶R、干擾素誘導黏病毒抵抗蛋白等[2-4],使機體處于抗病毒狀態(tài)。干擾素廣泛用于養(yǎng)殖業(yè),在藍耳病、口蹄病等病毒性疾病治療中效果顯著[5-6]。
豬α干擾素基因編碼166個氨基酸,其空間結構主要由5個α螺旋組成,無內(nèi)含子,有至少17個亞型[7-8]。豬α干擾素在機體內(nèi)分布廣泛,但表達量較低,無法滿足生產(chǎn)需要[9]。因此許多學者利用基因工程對豬α干擾素進行研究。Lefevre等[10]對豬α干擾素進行體外克隆、基因序列分析和少量表達。陳濤等[11]改變豬α干擾素第86 位氨基酸, 并對其密碼子進行優(yōu)化,獲得蛋白活性為52 000 IU/mg的突變體。李爽等[12]改變豬α干擾素不同的氨基酸活性位點,獲得了蛋白活性為2.97× 108IU/mg的突變體。本研究將天然豬α干擾素的第58位組氨酸H、59位谷氨酸E及61位亮氨酸L分別突變?yōu)槔野彼醂、天冬氨酸N及絲氨酸S,成功構建了豬α干擾素YNS突變體,運用大腸桿菌系統(tǒng)表達純化后,其抗病毒活性與天然豬α干擾素相比明顯提高,為干擾素的臨床應用提供理論基礎。
含有豬α干擾素基因的重組質粒、原核表達載體pET-32a、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH-5α和Rosetta(DE3)由河南省動物性食品安全重點實驗室保存。
Vero細胞和水泡性口炎病毒(VSV-Indiana)由中科院武漢病毒研究所惠贈。
限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司,豬α干擾素單克隆抗體(G16,Santa Cruz)購自北京百奧曼科技有限公司,羊抗鼠IgG(HRP標記)購自武漢三鷹生物技術有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
根據(jù)豬α干擾素基因(登陸號:AB369102.1)設計兩對引物, 其中F1和R1用于擴增完整的豬α干擾素基因并包含BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點,W1和W2反向互補且包含突變位點(表1)。引物由鄭州尚亞生物工程有限公司合成。
表1 引物序列
以豬α干擾素基因重組質粒為模板,利用F-1、W-1和W-2、R-1兩對引物進行PCR擴增,擴增片段命名為P1和P2。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,35個循環(huán)。反應結束后,以F-1、R-1為引物,以P1、P2為模板進行擴增,擴增程序如上。反應結束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
用BamHⅠ、XhoⅠ分別對PCR產(chǎn)物和表達質粒進行雙酶切,16 ℃連接。轉入大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆并送至武漢奧科生物有限公司進行序列測定。
將鑒定正確的陽性質粒轉至表達菌Rosetta中,挑選陽性克隆,37 ℃、200 r/min 振蕩擴大培養(yǎng)至OD值為0.6~0.8,加入IPTG(1 mmol/L)誘導8 h。收集菌體進行超聲波裂解,4℃、12 000 r/min離心,取沉淀和上清進行SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。
經(jīng)超聲波破碎后,4 ℃、12 000 r/min離心,4 mol/L尿素(無菌PBS配制)洗滌沉淀3次以除去雜蛋白,4 ℃、12 000 r/min離心。取適量的6 mol/L尿素溶解沉淀,分別用5、4、3、2、1 mol/L尿素溶液依次透析,每個階段6 h,最后用無菌的PBS(pH 7.2)透析24 h。測定蛋白含量,-80 ℃保存。
利用ToxinSensorTM內(nèi)毒素檢測試劑盒(L00350)檢測純化后干擾素內(nèi)毒素的含量,具體步驟參照試劑盒說明書。
VSV的半數(shù)細胞感染量(TCID50)測定:將Vero細胞接種到96孔板中, 24 h后每孔加入10倍倍比稀釋的VSV病毒100 μL,每個稀釋度設6個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h,按Reed-Muench法計算TCID50。
MTT法檢測干擾素在Vero細胞上的安全濃度:利用MTT試劑盒(索萊寶M1020-500T)檢測,酶聯(lián)免疫檢測儀在OD490nm處測量生物活性。
抗病毒活性的測定:采用細胞病變(CPE)抑制法在Vero-VSV系統(tǒng)上測定豬α干擾素突變體蛋白的抗病毒活性。同時對VSV的TCID50和基因拷貝數(shù)進行檢測。將Vero細胞接種到6孔板中,24 h后每孔加入濃度分別為100 ng/mL和1 ng/mL的干擾素100 μL,同時設置對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,試驗組每孔接入100 TCID50/0.1 mL VSV。培養(yǎng)至病毒對照組有75%細胞出現(xiàn)病變時,分別收取上清和細胞檢測。VSV(Real-time pCR)檢測方法及其標準曲線參照文獻[13]方法建立。引物序列如表1。
采用Prism 6.0進行的統(tǒng)計分析,每個數(shù)據(jù)重復3次,試驗數(shù)據(jù)是用平均值顯示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。
豬α干擾素突變體基因擴增產(chǎn)物,核酸電泳和測序顯示,擴增片段大小符合預期,長 501 bp并含有3個預期突變位點,與參照序列同源性97.6%。雙酶切鑒定結果顯示成功構建豬α干擾素突變體表達質粒(如圖2)。
M. DL 2000 DNA Marker;1. 片段P1; 2. 片段P2; 3. 豬α干擾素;N. 陰性對照
M. DL 5000 DNA Marker;1. pET-32a--IFN-α雙酶切產(chǎn)物; 2. pET-32a 雙酶切產(chǎn)物; 3. 豬α干擾素
將重組質粒轉入Rosetta(DE3)誘導表達,超聲破碎后,SDS-PAGE檢測(如圖3)結果顯示,蛋白分子量約33 kDa,符合預測結果,蛋白表達形式為包涵體。電泳結束后,將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上,與豬α干擾素單克隆抗體和羊抗鼠HRP抗體反應,結果顯示在33 kDa處顯示一條清晰的特異性條帶,與目的蛋白相對分子質量一致(如圖4)。
利用內(nèi)毒素檢測試劑盒,檢測純化后干擾素蛋白內(nèi)毒素的含量。檢測結果顯示,豬α干擾素突變體和參考蛋白的內(nèi)毒素(0.8 mg/mL)的檢測平均值分別為0.59 EU/mL和0.62 EU/mL,符合2015版《中國藥典》中通則1143要求(如圖5)。
M. 蛋白Marker;1. Rosetta;2. pET-32a空載體誘導;3.重組質粒pET-32a--IFN-α誘導;4. 沉淀中的重組蛋白;5. 上清中的重組蛋白
M. 蛋白Marker;1. 重組質粒pET-32a-IFN-α誘導;2. pET-32a空載體誘導
注:Y表示參照序列蛋白,YNS 表示豬α干擾素YNS突變體。下同
2.4.1 干擾素細胞安全濃度檢測
利用MTT法,在Vero細胞上檢測干擾素蛋白的安全濃度。結果表明,豬α干擾素突變體的CC50為462.7 μg/mL,參考序列蛋白的CC50為402.9 μg/mL,二者對細胞活性的影響呈現(xiàn)濃度依賴性,倍比稀釋到約25 μg/mL后對細胞增殖沒有影響(如圖6)。
2.4.2 抗病毒活性檢測結果
采用細胞病變抑制法,在Vero/VSV系統(tǒng)測定豬干擾素的抗病毒活性。檢測結果表明,豬α干擾素突變體表現(xiàn)出較高的抗病毒活性,突變體蛋白活性為1.63×106IU/mg。利用TCID50和Real-time PCR測定病毒滴度和基因拷貝數(shù),結果顯示豬α干擾素能夠有效地抑制VSV增殖,與參考序列蛋白相比差異顯著,具有更高的生物活性。
圖6 細胞活性檢測
注:*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同
圖8 VSV基因拷貝數(shù)測定
豬α干擾素具有速效廣譜的抗病毒效應,在預防和治療病毒性疾病方面發(fā)揮著不可替代的作用[14]。近年來,國內(nèi)外許多學者利用原核、真核和桿狀病毒等表達系統(tǒng)對干擾素進行表達[15-17]。Lefevre等[8]在大腸桿菌中表達豬α干擾素,并對其生物活性檢測。曹瑞兵等[18]對豬α干擾素密碼子進行優(yōu)化,獲得干擾素蛋白的生物活性為6. 4×106IU/mg。王彥彬等[15]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達干擾素,蛋白在細胞上有效抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的增殖。Huang等[17]利用基因工程的方法改變豬α干擾素基因并在畢赤酵母中大量表達,獲得了具有高活性的干擾素。
研究表明,改變?nèi)薎FNα2的3個氨基酸位點H57Y、E58N和Q61S,可使其活性相比野生型人IFN-α2得到提高[19]。人干擾素α和豬α干擾素同源性高達70%,因此本試驗采用融合PCR的方法克隆包含58、59和61位氨基酸突變位點的豬α干擾素突變體基因,利用大腸桿菌系統(tǒng)表達突變體,優(yōu)化蛋白純化方式,縮短了純化時間,更加適合大規(guī)模制備和生產(chǎn)應用。
本試驗利用試劑盒檢測純化后的豬α干擾素內(nèi)毒素殘留,結果表明,內(nèi)毒素含量低于1 EU/mg,符合細胞因子制品標準。MTT試驗結果表明突變體蛋白的抗增殖能力呈現(xiàn)濃度依賴性,在蛋白濃度為25 μg/mL時,不影響Vero細胞增殖,對細胞無毒性。試驗還運用TCID50和Real-time PCR方法分別從病毒滴度和病毒基因拷貝數(shù)上探究豬α干擾素抑制VSV增殖的能力。結果表明,YNS突變體和參照序列蛋白均能顯著降低VSV的病毒滴度和基因拷貝數(shù),YNS突變體抑制病毒增殖作用更明顯,與參照序列蛋白相比降低約2個病毒滴度和2log10病毒基因拷貝數(shù)。
王彥彬等[16],通過對干擾素與其受體IFNAR2三級結構分析,突變豬α干擾素與受體結合的氨基酸位點,可以使豬α干擾素與受體更快、更緊密的結合,從而使干擾素活性增強,但是具體某個氨基酸的改變對干擾素活性影響較大,仍需進一步探究。
總之,本研究成功構建了新型豬α干擾素YNS突變體,表達純化后具有較高的生物活性,為干擾素的臨床應用提供理論基礎。