利用便攜式運(yùn)輸箱實(shí)現(xiàn)豬卵母細(xì)胞體外成熟

徐明珠，陶瑞鑫 ，賈超，牛培培，李娟*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 淮安市南農(nóng)大新農(nóng)村發(fā)展研究有限公司，江蘇 淮安 223005)

我國是養(yǎng)豬大國，不僅養(yǎng)豬數(shù)量和種豬市場世界第一，而且豬的遺傳資源豐富[1]。卵母細(xì)胞體外成熟、體外胚胎生產(chǎn)以及胚胎移植是保存和傳遞優(yōu)質(zhì)資源的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。采用合適的方法保存卵巢、運(yùn)輸卵巢和卵母細(xì)胞及可移植胚胎對(duì)于更好的利用資源尤為重要[2]。在實(shí)際生產(chǎn)中，受到運(yùn)輸距離、方式和溫度變化等因素影響，最終從卵巢中采集的卵母細(xì)胞質(zhì)量也會(huì)受到影響[3]，而卵母細(xì)胞的質(zhì)量直接影響后續(xù)胚胎發(fā)育，極大地限制了卵巢資源的利用。若能提高母豬卵巢體外運(yùn)輸質(zhì)量或使得卵母細(xì)胞在運(yùn)輸過程中實(shí)現(xiàn)體外成熟，將能更好的利用優(yōu)質(zhì)保種資源。目前，關(guān)于豬卵巢運(yùn)輸溫度、運(yùn)輸時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟率、體外授精率、胚胎發(fā)育率的影響已有較多報(bào)道[4-6]，但少有研究對(duì)運(yùn)輸過程中卵母細(xì)胞能否實(shí)現(xiàn)體外成熟以及胚胎在運(yùn)輸箱中的發(fā)育效率進(jìn)行報(bào)道。

胚胎移植是輔助生殖技術(shù)中最重要的環(huán)節(jié)之一[7]。輔助生殖過程中的多種因素決定其成功效率，其中就包括了胚胎的質(zhì)量、植入前胚胎保存與運(yùn)輸方式、胚胎移植過程中受體母豬生理狀況[8]以及胚胎運(yùn)輸容器等[9]。如果移植足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)胚胎，受體母豬將會(huì)獲得更高的妊娠機(jī)會(huì)[10]。然而，體外生產(chǎn)所得胚胎均需置于恒溫運(yùn)輸箱中運(yùn)輸?shù)截i舍進(jìn)行胚胎移植。通常實(shí)驗(yàn)室距離豬舍距離較遠(yuǎn)，長距離和長時(shí)間運(yùn)輸將影響最終用來移植的胚胎質(zhì)量。因此，運(yùn)輸箱的設(shè)計(jì)若能在保持恒溫的同時(shí)滿足胚胎體外培養(yǎng)條件，則能夠提高可用優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量。因此，本研究旨在使用一種能夠維持運(yùn)輸箱內(nèi)溫度恒定且滿足各類型存放容器的便攜式運(yùn)輸箱，并探究在運(yùn)輸箱中卵母細(xì)胞成熟效率和胚胎發(fā)育潛力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

除另有說明外，所有試劑均購于Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。

1.2 運(yùn)輸箱選擇

選用如圖1所示的便攜式運(yùn)輸箱。其含兩種類型插孔以容納1.5 mL和0.5 mL離心管且中間部分設(shè)有凹槽用來固定0.25 mL麥管。

A.插孔與凹槽標(biāo)記；B. 放入離心管與麥管

1.3 運(yùn)輸箱溫度穩(wěn)定性評(píng)估

運(yùn)輸箱外接電源后，每隔2 h用溫度計(jì)讀取運(yùn)輸箱內(nèi)1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管的溫度，并分別記為1.5 mL T、0.5 mL T和0.25 mL T。運(yùn)輸箱未外接電源時(shí)，同樣每隔2 h使用溫度計(jì)讀取箱內(nèi)溫度，直至電源耗盡，1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管的溫度分別記為1.5 mL T′、0.5 mL T′ 和0.25 mL T′。

1.4 卵母細(xì)胞成熟率及質(zhì)量評(píng)估

從后備母豬卵巢中，采集具有良好形態(tài)特征的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)，并在IVM培養(yǎng)基中進(jìn)行體外成熟(TCM-199中添加10%慶大霉素、10%卵泡液、0.8 mmol/L L-谷氨酰胺、75 μg/mL青霉素、50 μg/mL硫酸鏈霉素、15 IU/mL孕馬血清以及15 IU/mL人絨毛促性腺激素。所用COCs隨機(jī)分為以下4組：A組(對(duì)照組)，四孔板每孔放入約60個(gè)COCs，置于38.5℃、5% CO2、20% O2的培養(yǎng)箱(Thermo Scientific, American)中連續(xù)培養(yǎng)42～44 h；B組，在1.5 mL離心管(Axygen, Mexico)中放入約60個(gè)COCs；C組和D組，分別在0.5 mL離心管(Axygen, Mexico)中放入約30個(gè)COCs、0.25 mL麥管中放入約20個(gè)COCs，置于38.5 ℃運(yùn)輸箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)42～44 h。

為進(jìn)一步評(píng)估在運(yùn)輸箱中成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)量，將不同組別優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活(PA)生產(chǎn)胚胎。具體步驟如下：體外培養(yǎng)42～44 h后，用透明質(zhì)酸酶(1 mg/mL)吹打去除卵丘細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞死亡率、MII期成熟率。挑選已排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞，在0.5 mm融合槽中使用0.86 kV/cm的單直流脈沖,持續(xù)80 μs電激活 (model 450, BTX, San Diego, CA, USA)，隨后轉(zhuǎn)移至含10 μg/mL放線菌酮(CHX)和5 μg/mL 細(xì)胞松弛素B (CB)的PZM-3培養(yǎng)基中，置于38.5 ℃、5% CO2、20% O2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)4 h化學(xué)激活。根據(jù)成熟卵母細(xì)胞來源，將所生產(chǎn)PA胚胎被分為4組，既A-A′，B-B′，C-C′，D-D′。激活的PA胚胎繼續(xù)以其來源的卵母細(xì)胞對(duì)應(yīng)的環(huán)境體外培養(yǎng)，分別于24 h和48 h統(tǒng)計(jì)其分裂率。因運(yùn)輸箱在未外接電源時(shí)，60～64 h電量耗盡，因此未能繼續(xù)PA胚胎體外培養(yǎng)到囊胚期。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件(IBM SPSS Statistics 20.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過卡方檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，P<0.05時(shí)差異顯著，P>0.05時(shí)差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸箱溫度維持

如圖2所示，無論運(yùn)輸箱是否外接電源，1.5 mL T與1.5 mL T′、0.5 mL T與0.5 mL T′、0.25 mL T與0.25mL T′ 之間溫度無顯著差異，溫度均維持在38 ℃，且T與T′ 溫差保持在±0.2 ℃內(nèi)。而0.25 mL T與0.25 mL T′ 相對(duì)較低，維持在37.3 ℃。由圖1可知，運(yùn)輸箱內(nèi)1.5 mL、0.5 mL離心管及0.25 mL麥管放置結(jié)構(gòu)不同，使得0.25 mL麥管與空氣接觸面積更大，這可能是導(dǎo)致0.25 mL麥管溫度維持恒定但相對(duì)較低的原因。

圖2 運(yùn)輸箱內(nèi)溫度變化情況

2.2 卵母細(xì)胞在運(yùn)輸箱中能夠進(jìn)行體外成熟

不同培養(yǎng)條件下COCs體外成熟44 h后卵丘細(xì)胞擴(kuò)散情況如圖3所示。B組和C組與A組相比，其卵丘細(xì)胞擴(kuò)散表型一致。而D組卵丘細(xì)胞擴(kuò)散相對(duì)較差。卵母細(xì)胞死亡率、MII期成熟率統(tǒng)計(jì)情況如表1所示，盡管D組卵丘細(xì)胞擴(kuò)散情況不如其他組別好，但A，B，C和D組卵母細(xì)胞死亡率與成熟率均無顯著差異。

選擇含有第一極體且細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)致密均勻的優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞(圖4)，生產(chǎn)孤雌激活胚胎。各組胚胎發(fā)育能力如表2所示， B-B′組胚胎2-細(xì)胞分裂率顯著高于C-C′和D-D′組，但4組胚胎繼續(xù)發(fā)育到4-細(xì)胞階段時(shí)分裂率無顯著差異。

A.培養(yǎng)箱條件下，COCs置于四孔板中體外成熟；B. 運(yùn)輸箱條件下，COCs置于1.5 mL離心管中體外成熟；C. 運(yùn)輸箱條件下，COCs置于0.5 mL離心管中體外成熟；D. 運(yùn)輸箱條件下，COCs置于0.25 mL 麥管中體外成熟；E. 未成熟卵母細(xì)胞

圖4 優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞

表1 運(yùn)輸箱中卵母細(xì)胞的體外成熟效率

表2 不同成熟條件下PA胚胎發(fā)育效率

3 討論

無論以何種技術(shù)體外生產(chǎn)所得豬胚胎都需通過運(yùn)輸箱儲(chǔ)存運(yùn)送至豬舍后進(jìn)行胚胎移植手術(shù)[11]?？梢浦才咛ベ|(zhì)量很大程度受卵母細(xì)胞質(zhì)量影響。成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量與早期胚胎發(fā)育能力密切相關(guān)，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞生產(chǎn)所得胚胎具有更高的發(fā)育潛力。影響豬卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的因素除了成熟時(shí)間和使用的成熟培養(yǎng)基類型外，還包括培養(yǎng)濕度、氣體組分和溫度等微環(huán)境，其中溫度是維持胞質(zhì)正常成熟最重要的微環(huán)境因素[12-13]。母豬經(jīng)超數(shù)排卵后回收所得的卵母細(xì)胞或屠宰場回收的卵巢均需要在短時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室以降低損傷[2,14]。在運(yùn)輸過程中卵母細(xì)胞的質(zhì)量會(huì)受到培養(yǎng)基類型和體積、運(yùn)輸容器以及運(yùn)輸中溫度的穩(wěn)定性等因素的影響[15]。胚胎在液體環(huán)境中被運(yùn)輸直到移植到受體母豬體內(nèi)的過程也需要維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，而運(yùn)輸過程中溫度穩(wěn)定性是關(guān)鍵因素，不穩(wěn)定的溫度會(huì)影響移植前胚胎的質(zhì)量[16]。如果在運(yùn)輸過程溫度不斷變化則會(huì)導(dǎo)致胚胎或卵母細(xì)胞后續(xù)發(fā)育異常甚至死亡[17]。已有研究報(bào)道，卵母細(xì)胞可在一種便攜式培養(yǎng)箱中完成體外成熟[18]。我們的研究結(jié)果同樣顯示，運(yùn)輸箱在外接或不接電源情況下均能維持豬卵母細(xì)胞發(fā)育所需恒定溫度，并且卵母細(xì)胞在運(yùn)輸箱中能夠完成體外成熟，且成熟率與培養(yǎng)箱成熟率相比不存在顯著差異。因此，運(yùn)輸箱可用于體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞且能夠支持早期PA胚胎發(fā)育。

完全生長COCs外周包裹多層卵丘細(xì)胞，卵丘細(xì)胞通常被認(rèn)為是卵母細(xì)胞胞質(zhì)與卵泡液直接的屏障，但卵丘細(xì)胞可借助間隙連接通過透明帶與卵母細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供所需營養(yǎng)物質(zhì)[19-23]。卵母細(xì)胞體外成熟過程中，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散程度常作為判斷卵母細(xì)胞成熟及成熟質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，各組卵丘細(xì)胞均正常擴(kuò)散，且卵母細(xì)胞體外成熟率無顯著差異。另外，豬卵母細(xì)胞中含有大量內(nèi)源性脂，內(nèi)源性脂是卵母細(xì)胞成熟過程中的重要能量來源[24-25]。已有研究表明，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的互作[26]、內(nèi)源性脂[27]以及PZM3[28]中的營養(yǎng)物質(zhì)已足夠促使卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。但卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育不僅所需要培養(yǎng)基中化學(xué)物質(zhì)的支持以及各成分合適的比例，也需要考慮培養(yǎng)溫度、氣體組分等微環(huán)境因素對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的影響[29]。哺乳動(dòng)物植入前胚胎對(duì)環(huán)境改變十分敏感，并且培養(yǎng)條件會(huì)直接影響其后續(xù)生長和發(fā)育潛力。因此，培養(yǎng)環(huán)境的物理?xiàng)l件對(duì)于胚胎質(zhì)量同樣至關(guān)重要。在研究中，盡管在運(yùn)輸箱中成熟的卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎早期發(fā)育能力并未表現(xiàn)出顯著缺陷，但在運(yùn)輸箱內(nèi)體外成熟過程中一些分子機(jī)制的改變可能會(huì)對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育及其質(zhì)量存在潛在影響[30-31]。在我們的研究中，無論是在培養(yǎng)箱還是在運(yùn)輸箱中培養(yǎng)，卵母細(xì)胞成熟液和胚胎培養(yǎng)基相同，并且在一定時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸箱可以保持相對(duì)穩(wěn)定的溫度供卵母細(xì)胞成熟和胚胎早期發(fā)育，但仍需考慮培養(yǎng)箱與運(yùn)輸箱之間存在氣體含量、濕度等不可控差異，這些潛在的物理?xiàng)l件差異可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量的發(fā)育潛力存在差異。

綜上所述，在溫度維持穩(wěn)定的運(yùn)輸箱中可實(shí)現(xiàn)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體體外成熟，以及支持孤雌激活胚胎完成至少兩次卵裂，且體外成熟效率以及4-細(xì)胞階段卵裂率并未受到顯著影響。