利用人胚胎干細(xì)胞來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系追蹤成年造血過程

朱瑤瑤,張朔,王征宇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所), 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 天津 300020

人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell，hPSC)主要包括人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)，其特征包括自我更新能力和多向分化潛能，是目前科學(xué)研究中常用的工具細(xì)胞系。hPSC體外造血分化為研究人體造血發(fā)育提供了一種簡便的途徑，也為探索造血發(fā)育過程中的分子動力學(xué)機(jī)制提供了新策略[1]。前期研究表明，在胚胎造血發(fā)育中主要經(jīng)歷原始造血和成年造血過程[2-3]，其中成年造血對造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)的產(chǎn)生必不可少[4-5]，因此區(qū)分原始造血和成年造血過程有利于體外產(chǎn)生功能性血細(xì)胞，也是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

Runx1是造血發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子，包括a、b、c 3種亞型，其中Runx1c是生血內(nèi)皮(hemogenic endothelium，HE)中唯一的亞型，也是成年HSC唯一表達(dá)的亞型[6]。前期研究表明，hESC中Runx1c的表達(dá)可以促進(jìn)HE產(chǎn)生造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell，HPC)[6]。同時，Runx1c主要表達(dá)在E10.5～E11.5的小鼠胚胎主動脈-性腺-中腎(aorta-gonado-mesonephros，AGM)區(qū)，該區(qū)域?yàn)轶w內(nèi)HSC產(chǎn)生的部位[7]，因此，Runx1c在HSC的產(chǎn)生過程中具有非常重要的作用。當(dāng)前，關(guān)于Runx1c和造血相關(guān)性的研究已有報(bào)道，但Runx1c在造血發(fā)育中的動態(tài)表達(dá)尚未被研究過。

近年來，CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展，已然成為基因編輯的有力手段[8]，極大地方便了科學(xué)研究的進(jìn)行。因此，本研究利用該技術(shù)構(gòu)建hESC來源的Runx1c- mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的hPSC體外單層造血分化體系[9]，動態(tài)追蹤人早期造血發(fā)育中Runx1c的表達(dá)情況，以期為解析成年造血過程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

H1-hESC細(xì)胞系購于美國Wicell干細(xì)胞庫；本研究所用質(zhì)粒均由張孝兵教授實(shí)驗(yàn)室(美國羅馬琳達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院)構(gòu)建并惠贈。

Essential 8TMMedium和TrypLETMSelect (1×)購于美國Gibco公司；Corning?Matrigel?hESC-Qualified Matrix購于美國Corning公司；STEMdiffTMAPELTM1 Medium購于美國STEMCELL公司；ROCK激酶抑制劑Y27632購于美國PEPROCELL公司；骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)、激活素A(Activin Beta-A chain，ActivinA)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購于美國Peprotech公司；CHIR99021糖原合酶激酶3β(glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β)抑制劑購于美國ABM公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) 購于美國Roche公司；RNeasy Mini Kit(50) 購于德國QIAGEN公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304) 購于天根生化科技(北京)有限公司。

免疫熒光抗體：Oct-3/4 mouse IgG購于美國Santa Crua公司；Nanog mouse IgG購于美國BD Biosciences公司；Tra1-60 mouse IgM購于美國Millpore公司；二抗Goat anti mouse IgM Alexa Fluor 555和Goat anti mouse IgG Alexa Fluor 647購于美國Invitrogen公司。流式抗體：anti-SSEA4 Alexa Fluor 555購于美國BD Biosciences公司；anti-human Oct3/4 PE和anti-human CD34 APC購于美國eBiosciences公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMix購于美國KAPA Biosystems公司。

1.2 hESC的培養(yǎng)和傳代

為了構(gòu)建hESC來源的報(bào)告細(xì)胞系，首先進(jìn)行hESC的培養(yǎng)和傳代。H1-hESC細(xì)胞在包被有Matrigel基質(zhì)的培養(yǎng)板中懸于E8培養(yǎng)液培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，使用0.5 mmol·L-1EDTA進(jìn)行傳代。首先棄掉E8培養(yǎng)液，加入EDTA消化液，使其覆蓋板底。待顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變亮、克隆由致密變疏松、細(xì)胞間孔隙增大時，輕輕吸出消化液。加入E8培養(yǎng)液吹下細(xì)胞，將細(xì)胞懸液混勻后，種相應(yīng)細(xì)胞數(shù)到Matrigel基質(zhì)包被的培養(yǎng)板上。在培養(yǎng)液中加入10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，并于24 h后撤掉?？寺〖s3～4 d長好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或者繼續(xù)傳代。

1.3 利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞系

為了在hESC的Runx1c位點(diǎn)準(zhǔn)確插入mNeonGreen報(bào)告基因片段，利用CRISPR-Cas9技術(shù)通過核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式對H1-hESC進(jìn)行基因組的重編輯。采用雙切質(zhì)粒載體代替?zhèn)鹘y(tǒng)載體[8]，即在同源重組(homology-directed repair, HDR)模板兩側(cè)各加入一段單向?qū)NA(single guide RNA, sgRNA)識別序列，使CRISPR相關(guān)蛋白核酸酶-9(CRISPR-associated protein-9 nuclease，Cas9)對基因組進(jìn)行切割的同時也使質(zhì)粒線性化，并聯(lián)合B細(xì)胞淋巴瘤-特大(B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL)基因瞬時過表達(dá)的方法將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)入H1-hESC(圖1)。

首先，在70 μL的核電轉(zhuǎn)溶液(lonza)中加入1 μg Cas9質(zhì)粒、0.5 μg的sgRNA質(zhì)粒、0.5 μg的sgDocut質(zhì)粒(用于切割pDonor)、1 μg pDonor質(zhì)粒和0.5 μg BCL-XL質(zhì)粒。待H1-hESC長到密度為70%左右，用TrepleE消化至單細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取1×106個細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄掉上清液。用核電轉(zhuǎn)溶液重懸后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至比色皿中并放入Amaxa Human Stem Cell Nucleofector?Kit 2 (lonza)電轉(zhuǎn)儀上執(zhí)行B-016程序，于37 ℃靜置5 min。將細(xì)胞接種到Matrigel包被的六孔板中，培養(yǎng)液換成E8，加入10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，放入孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)和傳代方法同1.2，并置于顯微鏡下觀察構(gòu)建后的細(xì)胞形態(tài)。

A：在Runx1c基因片段的1號外顯子(exon1)終止密碼子附近進(jìn)行基因編輯；B：質(zhì)粒載體以及聯(lián)合瞬時過表達(dá)BCL-XL的基因編輯方法。LHA—左端同源臂(left homologous arm)；RHA—右端同源臂(right homologous arm)。圖1 利用CRISPR-Cas9在Runx1c位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯的原理圖Fig.1 Schematic diagram of genome editing at the Runx1c locus using CRISPR-Cas9

1.4 PCR鑒定基因重組類型

為了檢測基因重組的類型，在顯微鏡下挑選1.3中電轉(zhuǎn)后接種的單細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)移至Matrigel包被的十二孔板中培養(yǎng)。然后待細(xì)胞密度達(dá)到70%時，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取培養(yǎng)細(xì)胞的基因組DNA，并擴(kuò)增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因，檢測是否插入mNeonGreen報(bào)告基因片段，同時以野生型H1-hESC為陰性對照、質(zhì)粒pU6-sgRunx1c為陽性對照。PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：DNA 0.5 μL，KAPA HiFi DNA polymerase 5 μL，上游引物(5′-CCAGAGGTATCCAGCAGA-3′)0.25 μL，下游引物(5′-GCACAACTTACTCGCACT-3′)0.25 μL，無核酸酶水4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小和目的基因插入類型。

1.5 Sanger測序檢測同源重組/非同源末端結(jié)合

為了進(jìn)一步檢測1.4中經(jīng)PCR鑒定為純合克隆的基因組序列是否正確，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取野生型H1-hESC和H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的基因組DNA。利用PCR擴(kuò)增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因，檢測是否插入mNeonGreen報(bào)告基因片段以及對基因序列進(jìn)行二代測序。PCR所用引物、反應(yīng)體系與反應(yīng)程序均與1.4相同。將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。將測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)、Galaxy(https://usegalaxy.org/)和Cas-analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#!)在線分析平臺進(jìn)行分析，利用Synthego(https://ice.synthego.com/)網(wǎng)站進(jìn)行ICE分析。

1.6 hESC來源的mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的多能性鑒定

1.6.1多能性蛋白的免疫熒光染色 為了檢測多能性蛋白的表達(dá)，在培養(yǎng)板中放入細(xì)胞爬片再包被Matrigel基質(zhì)，將細(xì)胞培養(yǎng)至密度為50%～60%，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液。隨后用PBS洗1次，用4% PFA固定30 min，再用PBST洗2次(每次15 min)。于Blocking buffer中室溫孵育1 h，加入一抗，4 ℃過夜。隨后用PBS洗2次(每次15 min)，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再用PBS洗2次(每次15 min)。加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，5 min后用PBS洗2次。最后，取出爬片，利用雙轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6.2實(shí)時熒光定量PCR檢測多能性基因表達(dá)

為了檢測基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)水平，利用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取野生型H1-hESC和H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的RNA，使用NanoDrop 1000 Spectrophotometer檢測RNA濃度。隨后，利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。最后，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：cDNA 1 μL，F(xiàn)aststart Universal SYBR Green Master 10 μL，上、下游引物各1 μL，無核酸酶水 7 μL。96孔PCR反應(yīng)板內(nèi)每個孔為1個反應(yīng)，按體積由大到小依次加入不同組分。封上PCR封口膜，瞬時離心混勻后放入實(shí)時定量PCR儀/Q3(Applied Biosystems)中。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40～45個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)孔，最后結(jié)果取平均值后采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。引物均由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

1.6.3數(shù)字核型 為了檢測電轉(zhuǎn)后細(xì)胞染色體核型是否發(fā)生變化，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的基因組DNA，進(jìn)行Illumina Asian Screening Array檢測和數(shù)據(jù)分析。并利用Log R比和B等位基因頻率等算法檢測細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6.4畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn) 為了檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞是否具有多能性，將3×106個細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠腹股溝皮下。注射8～12周后，小鼠有皮下腫瘤形成，完整剝離腫瘤進(jìn)行組織病理切片和HE染色，在顯微鏡下觀察HE染色后的組織切片。

1.7 H1-hESC來源的mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系體外單層造血分化

利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的hPSC體外單層造血分化體系[9]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞的密度達(dá)到70%～80%時，用TrypleE消化成單細(xì)胞懸液，以6×103個·孔-1接種于玻連蛋白包被的12孔板內(nèi)。更換造血誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液STEMdiff APEL，并向其中添加3 μmol·L-1GSK-3β抑制劑CHIR99021、2 ng·mL-1Activin A、10 ng·mL-1BMP4和10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，此時記為造血分化第0天(Day 0)。48 h之后(Day 2)換液，并加入10 ng·mL-1VEGF。造血分化第3天(Day 3)，直接加入10 ng·mL-1bFGF。造血分化第4天(Day 4)，換液并加入10 ng·mL-1VEGF和10 ng·mL-1bFGF的培養(yǎng)基至造血分化第6天(Day 6)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測Runx1c的表達(dá)

為了追蹤H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系在造血分化的不同階段Runx1c的表達(dá)情況，參照1.7中的H1-hESC來源的mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系體外單層造血分化方法，將造血分化第2天、第4天和第6天的細(xì)胞棄掉上清液，加入TrypleE解離成單細(xì)胞懸液，1 200 r·min-1離心5 min，將細(xì)胞重懸于300 mL PBE(含2% FBS和0.5 mmol·L-1EDTA)，利用BD CantoⅡ流式分析儀檢測Runx1c-mNeonGreen的比例，并用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

然后，從1.4中經(jīng)PCR鑒定的雜合克隆中隨機(jī)選取了28個單細(xì)胞來源的細(xì)胞系，誘導(dǎo)造血分化至第4天(方法參照1.7)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同單細(xì)胞來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的分化效率，利用BD CantoⅡ流式分析儀檢測Runx1c-mNeonGreen的比例，并用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5軟件分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SEM)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Student Test檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系

本研究采用雙切質(zhì)粒載體聯(lián)合BCL-XL瞬時過表達(dá)的方法，將pEF1-BCL-XL、pEF1-Cas9、pU6-sgRunx1c-mNeonGreen、pDonor-sg和pU6-sgDocut 5種質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)入H1-hESC(圖1)。隨后，對單細(xì)胞形成的共22個克隆分別傳代(10代以上)擴(kuò)增，取其基因組DNA與野生型H1-hESC(陰性對照)和質(zhì)粒pU6-sgRunx1c(陽性對照)同時進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因。若以HDR形式進(jìn)行基因編輯的純合細(xì)胞克隆，PCR產(chǎn)物位置與質(zhì)粒pU6-sgRunx1c-mNeonGreen相同(1.2 kb附近)，而未進(jìn)行基因編輯的細(xì)胞克隆PCR產(chǎn)物位置與野生型H1-hESC相同(500 bp附近)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在挑選的22個克隆中有3個雜合克隆、18個未編輯的克隆和1個純合克隆，基因編輯效率為18.2%(圖2A和表2)。進(jìn)一步對純合克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger法測序，通過NCBI、Galaxy和Cas-analyzer在線分析平臺分析測序數(shù)據(jù)，并利用Synthego網(wǎng)站進(jìn)行ICE分析，結(jié)果也證實(shí)目的基因片段Runx1c-mNeonGreen以HDR形式插入基因組(圖2B)。上述結(jié)果表明，成功建立了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系。

2.2 H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系多能性鑒定

2.2.1細(xì)胞表達(dá)多能性基因和蛋白 由2.1可知，通過CRISPR-Cas9方法成功獲得了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系，并且，其可在Matrigel包被的E8培養(yǎng)基中無限傳代。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞仍然具有正常H1-hESC樣的形態(tài)特征(圖3A)。而實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系表達(dá)多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的水平與野生型H1-hESC沒有顯著性差異(圖3B)。同時，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)多能性蛋白Tra1-60、NANOG、OCT4的表達(dá)率均在90%以上(圖4A)。免疫熒光染色檢測胞內(nèi)蛋白和表面蛋白也證實(shí)細(xì)胞可表達(dá)多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4(圖4B)。上述結(jié)果表明，已建立的H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系仍然具有多能性。

A：電轉(zhuǎn)細(xì)胞的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，E1—純合突變，E2、E3、E4—雜合突變，H1—野生基因型H1-hESC(陰性對照)，質(zhì)?！猵U6-sgRunx1c-mNeonGreen(陽性對照)；B：Sanger測序數(shù)據(jù)顯示在Runx1c 1號外顯子位點(diǎn)精確插入mNeonGreen序列。圖2 電轉(zhuǎn)后的PCR分析和Sanger測序情況Fig.2 PCR analysis and Sanger sequencing after electroporation

表2 不同類型的基因編輯效率Table 2 Different types of gene editing efficiency

A：H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的顯微鏡下形態(tài)；B：實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的多能性基因NANOG、OCT4、SOX2的相對表達(dá)量圖3 H1-hESC來源的Runx1c-mNeoGreen報(bào)告細(xì)胞形態(tài)及多能性基因表達(dá)Fig.3 The morphology and pluripotency gene expression of H1-hESC-derived Runx1c-mNeoGreen reporter cell line

A：細(xì)胞免疫熒光染色檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的多能性蛋白TRA1-60、NANOG和OCT4表達(dá)情況；B：流式細(xì)胞分析術(shù)檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4表達(dá)情況圖4 多能性蛋白檢測Fig.4 The detection of pluripotency protein

2.2.2細(xì)胞染色體核型正常 為了檢測基因編輯后是否影響基因組的穩(wěn)定性，通過Illumina Asian Screening Array進(jìn)行數(shù)字化核型檢測，這種方法比常規(guī)的G-顯帶核型分析更容易識別小片段的DNA缺失或重復(fù)。分析結(jié)果表明未檢測到拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸突變(single nucleotide polymorphism，SNP)。結(jié)果表明，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的染色體核型正常(圖5)。

圖5 數(shù)字化核型檢測Fig.5 The detection of digital karyotype

2.2.3細(xì)胞具有多向分化潛能 為了檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系是否具有多向分化潛能，進(jìn)行了畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，若有內(nèi)、中、外3個胚層的組織形成，證明該細(xì)胞具有多向分化潛能。注射細(xì)胞8周后，在NOD/SCID免疫缺陷小鼠腹股溝皮下可見腫瘤形成。完整剝離腫瘤組織進(jìn)行病理組織切片及H&E染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織具有三胚層結(jié)構(gòu)(圖6)。以上結(jié)果表明，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系仍然具有多向分化潛能。

注：箭頭所指組織分別為氣管(外胚層)、肌肉(中胚層)、和腺體(內(nèi)胚層)。 圖6 三胚層特征Fig.6 Characterization of three germ layers

2.3 利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系追蹤成年造血過程

與體內(nèi)胚胎造血發(fā)育相似，hPSC體外造血分化一般可分為以下步驟：Brachyury(T)+中胚層誘導(dǎo)，CD34+CD144+HE特化，最后經(jīng)過內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)變(endothelial-to-hematopoietic transition，EHT)產(chǎn)生CD43+HPC[10-12]。為了探究H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系在造血分化中的示蹤作用，利用之前建立的逐級造血分化體系[9]，檢測早期造血發(fā)育不同階段Runx1c的表達(dá)。如圖7A所示，造血分化第0天到第2天(Day 0—Day 2)是中胚層形成階段，Activin A、BMP4和Wnt信號通路激活劑(CHIR99021)可以加速Brachyury+中胚層祖細(xì)胞(mesodermal progenitor，MP)的產(chǎn)生；第2天到第4天(Day 2—Day 4)是HE特化階段，在VEGF和基礎(chǔ)成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生CD34+CD144+HE；第4天到第6天(Day 4—Day 6)是EHT階段，在VEGF和bFGF的持續(xù)誘導(dǎo)下，在第6天可以產(chǎn)生CD43+HPC。隨后，在造血分化第0天將純合H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系和H1同時進(jìn)行造血分化誘導(dǎo)，利用流式細(xì)胞術(shù)在分化的不同階段檢測Runx1c的表達(dá)(圖7B)。

進(jìn)一步隨機(jī)選取了雜合的其他28個單細(xì)胞來源的細(xì)胞系，誘導(dǎo)造血分化至第4天，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同單細(xì)胞來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的分化效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Runx1c在造血分化第2天就已表達(dá)，在接下來的HE特化階段和EHT階段持續(xù)表達(dá)，但是表達(dá)水平逐漸下降(表3)。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了H1-hESC來源的純合和雜合Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系，在本實(shí)驗(yàn)室的單層造血分化體系中，有誘導(dǎo)分化第2天時，主要由中胚層構(gòu)成[9]，而造血系統(tǒng)來源于中胚層，因此，提示可以利用該報(bào)告細(xì)胞系追蹤體外造血分化中與成年造血密切相關(guān)的Runx1c的動態(tài)表達(dá)。

A：誘導(dǎo)hPSC產(chǎn)生早期HPC的策略圖；B：H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系在造血分化不同階段表達(dá)Runx1c的情況圖7 利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系追蹤成年造血過程Fig.7 Tracking the definitive hematopoiesis by the H1-hESC derived-Runx1c-mNeonGreen reporter cell line

表3 不同單細(xì)胞來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系的分化效率Table 3 The differentiation efficiency of different single cell derived-Runx1c-mNeonGreen reporter cell line

3 討論

Runx1是造血發(fā)育中重要的調(diào)節(jié)因子，也是核心結(jié)合因子(core-binding fators，CBF)復(fù)合體的α亞單位，是與人類白血病相關(guān)的最常見的染色體易位部位[13-14]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Runx1主要與胚胎造血中的成年造血以及HSC的產(chǎn)生有關(guān)[15-17]。已有研究表明，盡管Runx1缺失不影響原始造血以及卵黃囊血管的生成，但是胚胎仍然會在E11.5成年造血發(fā)生的時間點(diǎn)因出血或者缺血而死亡[15-16]。Runx1有不同的啟動子和不同的剪接方式，存在多種亞型，其中，Runx1a和Runx1b由P2啟動子啟動表達(dá)，而Runx1c由P1啟動子啟動表達(dá)[18-19]。Runx1a和Runx1b在造血發(fā)育的全過程均表達(dá)，而Runx1c只在成體HSC出現(xiàn)的時間點(diǎn)表達(dá)，而且在所有成體HSC出現(xiàn)的部位均有表達(dá)[7]。在hESC的分化中發(fā)現(xiàn)Runx1c的表達(dá)平行于其他造血相關(guān)表面標(biāo)志的表達(dá)，并且限于CD34+的細(xì)胞亞群中[20]。Runx1c是hPSC造血分化中最早上調(diào)表達(dá)的亞型，其首先在HE中表達(dá)，而其他Runx1亞型在隨后出現(xiàn)的CD45+血細(xì)胞中表達(dá)。在hESC中組成型表達(dá)Runx1c會增加HE和CD45+血細(xì)胞的產(chǎn)生，而特異性敲除Runx1c則會影響HE的造血命運(yùn)特異化[9]。因此，Runx1c亞型對功能性成體造血細(xì)胞的產(chǎn)生十分重要。

hPSC是一群具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞群體，在基礎(chǔ)研究和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景，也是研究體外造血分化的有效工具[21]。對hPSC進(jìn)行基因編輯為研究基因功能、構(gòu)建疾病模型等提供了可能[22]。CRISPR-Cas9技術(shù)是基因編輯的有力手段[23]，然而大部分的細(xì)胞會在電轉(zhuǎn)質(zhì)粒之后死亡，由此造成的基因編輯效率低下的問題限制了CRISPR-Cas9在hPSC中的應(yīng)用[24-25]。BCL-XL是抗凋亡基因家族中的一種，可以維持線粒體外膜的完整性，防止線粒體內(nèi)容物細(xì)胞色素c的釋放，促進(jìn)hPSC的單細(xì)胞存活率[26-27]。已有研究表明，通過瞬時過表達(dá)BCL-XL可以顯著提高基因編輯效率[25]。另一方面，精準(zhǔn)的基因編輯還有賴于雙鏈DNA(double strand DNA，dsDNA)斷裂之后的HDR修復(fù)[23]。針對提高HDR修復(fù)效率的研究發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)粒模板兩側(cè)各加入一段sgRNA的識別序列，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞后，Cas9對基因組進(jìn)行切割的同時也會使質(zhì)粒線性化，可以使HDR效率提高5～10倍以上[8]。

因此，在本研究中，通過雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的CRISPR-Cas9技術(shù)，實(shí)現(xiàn)hPSC的高效重編程并成功構(gòu)建了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系。本研究不僅提高了hPSC重編程效率，而且實(shí)現(xiàn)了以HDR形式在Runx1c的1號外顯子處原位插入mNeonGreen報(bào)告基因片段。這種雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的新型CRISPR-Cas9基因編輯方法對編輯后hPSC的自我更新和多向分化潛能均不產(chǎn)生影響，染色體核型也正常，所以該技術(shù)能夠在不影響細(xì)胞本身特征的情況下實(shí)現(xiàn)成功插入基因片段，有利于未來臨床轉(zhuǎn)化。

盡管很多研究發(fā)現(xiàn)Runx1c與胚胎造血發(fā)育中的成年造血密切相關(guān)[15-16]，但是到目前為止沒有報(bào)道連續(xù)監(jiān)測過Runx1c在人造血發(fā)育中的表達(dá)。因此，本研究首次利用hPSC體外單層逐級造血分化方法[9]，動態(tài)追蹤了Runx1c在人早期造血發(fā)育中的表達(dá)。另外，在以往的一些研究中，針對Runx1c和造血的關(guān)系，主要是圍繞HSC和血細(xì)胞展開，而不是HSC和血細(xì)胞產(chǎn)生的過程，即造血發(fā)育過程[7]。而在本研究中，針對Runx1c在造血發(fā)育過程中的影響進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)Runx1c在HE特化階段表達(dá)水平最高，EHT階段表達(dá)稍有下降，這提示了Runx1c不僅在血細(xì)胞中表達(dá)而且對造血命運(yùn)特化至關(guān)重要。本研究利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系主要探究了Runx1c在早期造血發(fā)育中的表達(dá)，而對晚期造血發(fā)育尤其是造血譜系特異化的研究還有待進(jìn)行。此外，本研究主要定位為細(xì)胞系構(gòu)建等技術(shù)性研究，重點(diǎn)介紹了如何利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建Runx1-c報(bào)告細(xì)胞系，尚缺乏后續(xù)的造血譜系及功能驗(yàn)證，這也以后的工作重點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的新型CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報(bào)告細(xì)胞系，并追蹤了Runx1c在人早期造血發(fā)育中的動態(tài)表達(dá)。本研究有利于闡明成年造血的產(chǎn)生過程，也為體外功能性血細(xì)胞的產(chǎn)生提供了可能。