硒與葉酸在抗病毒治療中的作用及其在植物中的應用前景分析

孫卉,張春義,姜凌

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

病毒是一種非細胞生命形態(tài)，它由一個核酸長鏈(DNA或RNA)和蛋白質外殼構成，必須寄生在活的寄主細胞內(nèi)進行增殖、轉錄和轉譯，然后按它自身核酸所包含的遺傳信息復制產(chǎn)生后代病毒，并進一步感染其他細胞。病毒危害人類健康，造成國民經(jīng)濟重大損失[1]。引起各類傳染病的病毒很多，例如：艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、柯薩奇病毒(克山病)、寨卡病毒、SARS(severe acute respiratory syndrome)冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、新型冠狀病毒(coronavirus disease 2019，COVID-19)等[2-5]。

2020年初，COVID-19疫情在全球范圍迅速擴散，感染病例呈指數(shù)級增長，是近百年來人類遭遇的影響范圍最廣的全球性大流行病。目前國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)，并認定這種病毒是SARS冠狀病毒的姊妹病毒。該病毒引起的肺炎癥狀一般為發(fā)熱、乏力、干咳，并出現(xiàn)呼吸困難，嚴重者表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、代謝性酸中毒和凝血功能障礙。COVID-19病毒傳染性強，且潛伏期也具有傳染性，目前沒有特異的治療方法[5]。在此次抗病毒治療中，我國研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19的報告治愈率與人群硒狀態(tài)(以發(fā)硒含量表征)之間顯著正相關，其中以高硒攝入量聞名的湖北省恩施市(男性發(fā)硒3.13±1.91 mg·kg-1，女性發(fā)硒2.21±1.14 mg·kg-1)的治愈率為36.4%，顯著高于湖北省其他城市的治愈率(13.1%)[6]；德國的研究發(fā)現(xiàn)患者的硒缺乏與COVID-19的高死亡風險密切相關[7]；以色列研究者發(fā)現(xiàn)重癥COVID-19患者血液中的葉酸含量只有正常人的三分之二[8]；葉酸是COVID-19的主要蛋白酶的抑制劑，高劑量的葉酸攝入有助于抑制病毒的活性[9]。這些情況說明微量營養(yǎng)素硒和葉酸在抗病毒治療中發(fā)揮一定的作用，提高人體內(nèi)硒和葉酸含量的膳食方案，可以有效地增加人體免疫能力來應對病毒性疾病的侵襲。目前，硒和葉酸是如何用于抗病毒等疾病的治療及如何協(xié)同提高硒和葉酸含量的植物營養(yǎng)強化工作都鮮見報導，因此本文綜述了硒和葉酸這兩種微量營養(yǎng)素在抗病毒治療中的機制、在其他疾病治療中的作用以及硒和葉酸的植物性營養(yǎng)強化膳食補充治療的應用前景，以期為提升營養(yǎng)品質、創(chuàng)制富含硒和葉酸的作物蔬果提供理論支撐。

1 硒和葉酸的生物學功能

硒是一種非金屬元素，是人和動物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素，在生殖、甲狀腺激素代謝、DNA合成以及防止氧化損傷和感染方面發(fā)揮著重要作用，也是植物生長的有益元素[10-11]。自然界中存在無機硒(硒酸鹽、亞硒酸鹽、單質硒、甲基硒)和有機硒(硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒多糖、硒核酸)兩種主要形式。缺硒地區(qū)容易發(fā)生克山病和大骨節(jié)病，全世界大約有10～15億人由于硒缺乏，導致心血管疾病、甲狀腺功能減退、男性不育和癌癥等疾患。適量補充硒有益健康，但過量的硒可引起硒中毒，主要表現(xiàn)為頭發(fā)變干變脆、皮膚損傷及神經(jīng)系統(tǒng)異常等[10]。

已有報道的生物體硒代謝途徑中，硒代半胱氨酸轉化為甲基硒代半胱氨酸的過程中需要甲基的供體(S-腺苷甲硫氨酸)作為輔酶(圖1A)[12]。此步反應的甲基供體由一碳代謝中的葉酸提供，5甲基四氫葉酸可以將同型半胱氨酸轉化成甲硫氨酸，再進一步轉化為S-腺苷甲硫氨酸，進而參與蛋白質、DNA及各類化合物的甲基化過程(圖1B和圖1C)[13]。

葉酸是動植物生長發(fā)育所必需的一類水溶性B族維生素[13-14]。人體自身不能合成葉酸，如果孕婦在孕期未能攝入足量葉酸，胎兒的核酸合成和DNA、蛋白質、脂質和磷脂的甲基化也會受阻，葉酸嚴重缺乏將導致新生兒的發(fā)育遲緩及神經(jīng)管發(fā)育缺陷。葉酸缺乏也會直接導致巨幼紅細胞性貧血和高同型半胱氨酸原發(fā)性高血壓，并會增加結腸癌、心血管疾病、老年癡呆癥、冠狀動脈硬化等多種疾病的患病風險[14]。

A：硒代謝；B：甲基代謝；C：葉酸代謝。ATP—三磷酸腺苷；SeCys—硒代半胱氨酸；SAM—S-腺苷甲硫氨酸；SAH—S-腺苷高半胱氨酸。圖1 生物體中硒和葉酸的代謝Fig.1 Metabolism of selenium and folate in organism

葉酸和硒等微量營養(yǎng)素缺乏會降低人體免疫力，促進病毒感染的進程。病毒感染又反過來加重微量營養(yǎng)素缺乏，形成惡性循環(huán)[7-8]。

2 硒和葉酸在抗病毒治療中的作用機制

2.1 人體的抗病毒反應

人體抗病毒反應是機體對病毒逐漸產(chǎn)生免疫的過程,機體對抗病毒的反應機理基本一致。通過疫苗和改善人體健康狀況可以增加免疫力，是應對病毒性疾病侵襲的有效途徑[15]。病毒攻擊的第一道防線是物理屏障(如皮膚和所有粘液膜)，這屬于先天性反應。第二道防線是固有免疫反應。如果病毒突破人體的第一道防線進入了機體，固有反應被激活。這個過程中自然殺傷細胞是這道防線的重要成員，它是淋巴細胞中除T細胞、B細胞外的另一類細胞，可以發(fā)現(xiàn)并殺死異常的細胞。被病毒感染的宿主細胞屬不正常細胞，因此亦在自然殺傷細胞攻擊范圍之內(nèi)，此時機體產(chǎn)生炎癥反應。第三道防線，其過程相對緩慢，包括特異性體液免疫和細胞免疫。特異性抗體與病毒結合后，病毒就不能與易感染細胞表面的相應受體結合而進入細胞。對已進入易感染細胞的細胞內(nèi)病毒，抗體無法進入，需要細胞免疫中的白細胞分化抗原，表達分化抗原的T細胞可以分化為細胞毒性T細胞，能夠特異性地殺傷靶細胞，最終消滅病毒[16]。過程中有兩種T細胞：輔助型T細胞1(T helper 1 cell，TH1)主要為對抗細胞內(nèi)細菌及病毒的免疫反應服務，其主要為白細胞介素12(interleukin 12，IL-12)所驅動誘發(fā)，主要的執(zhí)行細胞因子是干擾素-γ。TH1免疫反應對應的是第四型自體免疫疾病，過高的TH1激活將會導致巨噬細胞自體免疫疾病，例如麻風病。輔助型T細胞2(T helper 2 cell，TH2)是一種能夠分泌TH2型細胞因子(如白細胞介素IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等)的T細胞亞群，可以抑制TH1細胞增殖，同時輔助B細胞活化，發(fā)揮體液免疫的作用[15]。

2.2 硒在抗病毒治療中的作用機制

微量營養(yǎng)元素(包括多種維生素和微量礦物質)在機體免疫功能的發(fā)揮中起重要作用，微量營養(yǎng)素的缺乏或失衡狀態(tài)會對免疫功能產(chǎn)生負面影響，并降低人體對各類感染的抵抗力[17]。來自動物模型和人群流行病學的研究數(shù)據(jù)表明，缺乏硒可導致某些病毒的毒性增加和機體對病毒的易感性增加。例如：克山病是1935年在中國克山縣爆發(fā)的一種地方性心肌病，該地區(qū)人體硒營養(yǎng)極度缺乏，導致其對柯薩奇病毒的良性或弱毒性菌株的敏感度增加，易被感染[18]。硒缺乏也是重癥急性呼吸綜合征發(fā)病的因素之一，如COVID-19、SARS等[5]。研究者還發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎病毒感染會導致鋅、硒、維生素A和B12等微量營養(yǎng)素的缺乏，這些微量營養(yǎng)素會影響機體的抗氧化和免疫系統(tǒng)對丙型肝炎病毒的應激反應[3]。

在艾滋病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒和西尼羅病毒的治療中，提供充足或高硒營養(yǎng)的膳食補充可以緩解患者的多種癥狀[19]。其中，高活性抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)又叫雞尾酒療法，指通過3種或3種以上的抗病毒藥物和硒等微量營養(yǎng)素聯(lián)合使用來治療艾滋病。該療法的應用可以減少單一用藥產(chǎn)生的抗藥性，最大限度地抑制病毒的復制，甚至能夠全部恢復被破壞的機體免疫功能，從而延緩病程進展，延長患者生命和提高生活質量。研究表明與安慰劑組相比，一起服用硒和多種維生素(包括葉酸)能使患艾滋病并發(fā)癥的風險降低，還能降低艾滋病患者的死亡率[20]。

在免疫系統(tǒng)中，硒能刺激輔助型T細胞、細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞中的抗體形成和活性。硒參與機體抗病毒反應的免疫機制有三類[15]。第一類，硒能夠影響艾滋病毒的突變率，硒缺乏會增加病毒的突變率而導致病毒RNA的多重變化。以硒為輔酶的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase 1，TrxR1)已被鑒定為艾滋病病毒編碼、病毒復制所必需的蛋白負調(diào)控因子，高硒膳食使得宿主體內(nèi)的TrxR1大量富集，可以導致病毒由于不能復制而減少了致病性[21]。第二類，在固有免疫反應中，機體的硒狀態(tài)主要依賴細胞中具有抗氧化特性的硒代半胱氨酸的含量。硒代半胱氨酸是硒氧化酶的催化中心。例如谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GPX)就是一種硒氧化酶，可以通過中和代謝產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS，如H2O2、O2-、HO·等)調(diào)節(jié)生物氧化穩(wěn)態(tài)，還可以增加干擾素-γ的生成[22]。以流感病毒為例，它侵入后，宿主細胞線粒體和吞噬細胞氧化爆發(fā)中ROS生成增加，并發(fā)出啟動宿主細胞/生物分子免疫反應的信號，T細胞中的TrxR1和GPX生物合成迅速上升，減少ROS產(chǎn)生，以破壞和清除體內(nèi)的病毒[23]。而硒缺乏會導致T細胞向能殺傷病毒的細胞毒性T細胞分化，限制或延遲了宿主的免疫反應，還會影響人氣道上皮細胞的形態(tài)和宿主對病毒的防御反應。另一方面，在硒充足的條件下優(yōu)化GPX的表達活性可以保護受感染的細胞和組織免受病毒誘導的氧化損傷和細胞死亡[19，24]。補硒可以增強和加速細胞抗病毒免疫反應，但不會改變TH1/TH2平衡，也不會影響體液反應[25]。最新研究認為TrxR1為核糖還原為脫氧核糖合成所必需；低硒導致核糖積累，宿主DNA合成受阻，無法包裝形成新的病毒顆粒[26]。第三類，在適應性免疫反應中，硒可以維持抗體的水平、T細胞的繁殖和分化，還可以增加輔助型T細胞數(shù)量，并誘導位于內(nèi)質網(wǎng)中硒蛋白K(selenium protein K，SelK)的高表達，在免疫細胞激活過程調(diào)控鈣離子的平衡[15，27]。

圖2 硒在抗病毒治療中的機制Fig.2 Mechanism of selenium in treatment of antiviral

2.3 葉酸在抗病毒治療中的作用機制

充足的葉酸攝入對于確保身體屏障和免疫細胞的正常功能是必不可少的。在艾滋病患者中發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸和葉酸的水平都比正常人低，與HIV感染率有關[28]。葉酸也是HAART療法中不可缺少的一種組分[20]。但葉酸在參與抗病毒治療中的作用機制不同于硒。在第一道物理屏障防線中，葉酸參與維持腸道粘膜細胞的結構和功能完整性，對小腸調(diào)節(jié)性T細胞和人類腸道微生物的生存至關重要[29]；在第二道防線固有免疫反應中，葉酸參與維持或增強自然殺傷細胞的細胞毒活性[30]；在第三道防線適應性免疫反應中，葉酸參與TH1介導的免疫應答，同時還對抗體的產(chǎn)生非常重要[29]。因此葉酸的缺乏會導致自然殺傷細胞毒性活性降低，T細胞和細胞毒性T細胞的增殖受到抑制，胸苷和嘌呤合成受損并進一步影響DNA和RNA合成，免疫球蛋白分泌減少，抗體反應降低(圖3A)[15]。

葉酸不僅通過機體的免疫反應參加抗病毒治療，還可通過抑制感染細胞的葉酸合成代謝來殺死病毒感染后的細胞。在病毒引起的風濕綜合癥的治療過程中，葉酸結構類似物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)被廣泛應用[31]。在治療寨卡病毒的藥物篩查中發(fā)現(xiàn)MTX也是治療寨卡病毒的有效藥物[2]。寨卡病毒誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要體現(xiàn)為嬰兒小頭癥和格林-巴利綜合征，這是一種蚊蟲傳播的疾病[32]。MTX對二氫葉酸還原酶具有抑制作用，可以用于治療寨卡病毒引起的癥狀(圖3B)。一定治療條件下MTX可以使病毒的濃度下降10倍，抑制病毒復制。在病毒感染的細胞中，MTX在聚谷氨酸合成酶的作用下轉化為多聚谷氨酸尾的形式，然后和有活性的葉酸形成競爭性的抑制關系，從而抑制二氫葉酸還原酶、胸苷酸合成酶、亞甲基四氫葉酸還原酶等葉酸代謝酶的活性，影響嘌呤和嘧啶的合成，進一步導致被感染細胞的死亡[2]。

A：葉酸參與的人體免疫反應；B：葉酸代謝中，甲氨蝶呤是二氫葉酸合成酶的抑制劑圖3 葉酸在抗病毒治療中的作用Fig.3 Mechanism of folate in treatment of antiviral

3 硒和葉酸在植物營養(yǎng)強化中的應用前景

上述研究表明，在體內(nèi)平衡的有機硒和葉酸的含量對人體和動物都至關重要，因此提高植物中葉酸和有機硒的含量，繼而通過膳食有效地保障人體對硒和葉酸的攝入，是植物營養(yǎng)強化的主要任務之一。我國衛(wèi)生部2017年發(fā)布的最新《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》指出，我國成年人推薦每日硒的成人推薦攝入量為60 μg·d-1，最高每天可攝入400 μg的硒元素。葉酸的最高攝入量也為400 μg·d-1[33]。作物中一般有機硒含量在8～20 μg·100 g-1之間[11]，葉酸在20～80 μg·100 g-1之間[34]，科學家們基于對植物硒和葉酸代謝途徑了解的不斷深入，能夠設計不同的策略來有效提高植物中的有機硒和葉酸的含量。

植物是人體硒的直接來源之一，硒酸鹽是大多數(shù)土壤中硒的主要生物有效形式，可被植物的根吸收。硒在根中積累并轉移到莖中，硒的同化通常發(fā)生在葉片中，在ATP-磺?；?ATP sulfurylase，APS)、硒代半胱氨酸(SeCys)-甲基轉移酶(SeCys methyltransferase，SMT)和胱硫醚γ合酶(cystathionine gamma synthase，CgS)催化的一系列反應中，硒酸鹽被還原為亞硒酸鹽，然后被同化為SeCys和硒代甲硫氨酸(SeMet)。為了避免這些硒代氨基酸非特異性地結合到蛋白質中，SeCys和SeMet可被甲基化以產(chǎn)生無毒的非蛋白質氨基酸：甲基硒代半胱氨酸(methyl SeCys，MetSeCys)和甲基硒代蛋氨酸(methyl SeMet，MetSeMet)。SeCys可以分解成丙氨酸和元素硒。APS在無機硒向亞硒酸鹽轉化過程中起限速作用，CgS在硒從SeCys向SeMet的揮發(fā)過程中起限速作用，SMT在硒的超積累和耐受過程中起限速作用，均是硒營養(yǎng)強化在植物中的目標酶(圖1)[35]。低硒土壤中種植的植物(<0.55 mg·kg-1)不能為人體健康積累足夠數(shù)量的微量營養(yǎng)素[36]。而我國三分之二地區(qū)屬缺硒地區(qū)，未經(jīng)過植物營養(yǎng)強化獲得的糧食和蔬菜等食物含硒量較低[37]。硒參與了植物抵抗多種生物和非生物脅迫，例如可以改善光合特性、延緩葉片和果實衰老、增加植株產(chǎn)量、減少由重金屬、寒冷或干旱水分脅迫引起的氧化應激反應[38-39]。目前硒的植物營養(yǎng)強化有兩大類方法：一類是通過轉基因技術獲得富含硒的植物，另一類是通過在環(huán)境中添加無機硒或硒肥，促進植物中有機硒的形成。第一類方法在印度芥菜中將SMT、APS、CgS和谷胱甘肽合成酶GS的過度表達導致硒酸鹽的硒積累增加了2～9倍[40-42]。在番茄中，SMT的過度表達導致MetSeCys在果實中而不是在葉片中積累，果實中總硒的16%以MetSeCys的形式存在[43]。第二類方法的應用已非常廣泛，如富硒的番茄、玉米、水稻和生菜等作物蔬果的種植[44-47]。目前的研究結果表明，硒可促進葉片酚類化合物和谷胱甘肽的合成，降低根中鉬、鐵、錳、銅的含量[45]。葉面施的硒主要積累在胚乳中，對水稻籽粒平均產(chǎn)量沒有影響，對葉綠素指數(shù)、鉀、鈣和錳元素含量也沒有明顯影響，高濃度的硒導致籽粒中硫元素含量下降[45-46]。上述結果說明硒的營養(yǎng)強化有利于植物的生長發(fā)育。

葉酸的合成直接為一碳代謝提供甲基供體，間接參與硒的合成。葉酸代謝受到抑制時，植物的甲基代謝流也明顯受到影響[48]。葉酸代謝干擾后的含硒化合物的變化動態(tài)尚無報道。目前在植物中，比較有效的葉酸營養(yǎng)強化策略是同時引入葉酸生物合成基因三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶Ⅰ和分支酸合成酶，在此基礎上，又引入線粒體葉酸合成途徑中的下游基因焦磷酸激酶/二氫蝶呤合酶或葉酰谷氨酸合成酶，能使水稻籽粒中葉酸含量最高增加150倍、馬鈴薯塊莖中葉酸含量最高增加12倍(圖1C)[49-50]。此外植物可以直接吸收體外苯丙氨酸和葉酸等物質使體內(nèi)的葉酸含量提高。在水培菠菜中通過添加苯丙氨酸可以增加對氨基苯甲酸和蝶呤的水平，最終使菠菜中葉酸含量增加兩倍以上[51]；在水稻幼苗根部施加5甲酰四氫葉酸能夠顯著促進幼苗在低氮條件下的生長發(fā)育，株高、鮮重、葉綠素含量均有提高，葉酸衍生物含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量也顯著提高[52]。

硒和葉酸在植物中的協(xié)同營養(yǎng)強化可以通過轉基因過表達和外源添加兩種途徑，這為同時提高植物中硒和葉酸含量提供了可能性，具體實施的策略值得進一步研究探討。

4 展望

硒和葉酸是維持免疫系統(tǒng)應答的關鍵微量營養(yǎng)元素，使用硒或葉酸補充劑治療病毒病可能源于它預防病毒感染的潛力和增強人體免疫能力[19-20]。從已知的抗病毒治療中對人體營養(yǎng)狀況和植物營養(yǎng)強化的研究中，已經(jīng)明確多種營養(yǎng)素在抗病毒治療中的機制有所不同。如何將各類與抗病毒治療相關的微量營養(yǎng)素有效地協(xié)同在同一種植物中進行營養(yǎng)強化是亟待解決的科學問題。人類疾病的治療中已經(jīng)嘗試使用硒納米顆粒(selenium nanoparticles，SeNPs)介導葉酸靶向mRNA進入腫瘤細胞，來調(diào)控細胞內(nèi)的硒和葉酸代謝，進而參與免疫治療[53]。目前硒肥在我國已有應用[54]，如果在此基礎上研發(fā)富含葉酸的硒肥料，則有望實現(xiàn)硒和葉酸在植物中的同時強化，富含葉酸的硒肥料也能減少氮肥的施用，還可以通過遺傳育種等手段培育營養(yǎng)強化硒和葉酸作物蔬果新品種。

2019新冠肺炎疫情，讓我們意識到面對包括COVID-19在內(nèi)的威脅人類的病毒性疾病時，需要一種新穎的、富有創(chuàng)造性的、有效的綜合治療方法和膳食方案，來增加人們應對流行病和其他突發(fā)事件沖擊的營養(yǎng)抗逆能力。我國目前尚未開展硒和葉酸復合營養(yǎng)素的營養(yǎng)強化工作。未來可以通過國內(nèi)外協(xié)同合作，從膳食需求和營養(yǎng)角度推動我國作物蔬果復合營養(yǎng)素的強化育種工作，為大眾提供優(yōu)化“量”與“質”俱佳的作物蔬果品種和產(chǎn)品，從供給側入手，在開展育種技術提升、重大自主品種培育、高效精準栽培、綠色豐產(chǎn)關鍵技術集成四大科技行動的同時，提升作物蔬果復合營養(yǎng)素的品質，開發(fā)高營養(yǎng)附加值的作物蔬果種質資源，增加其經(jīng)濟效益、社會效益、生態(tài)效益和營養(yǎng)健康效益。