細(xì)胞凋亡反應(yīng)中NOXA基因啟動(dòng)子發(fā)揮增強(qiáng)子功能調(diào)節(jié)BCL2基因表達(dá)

秦中勇，石曉，曹平平，褚鷹，管蔚，楊楠，程禾，孫玉潔

研究報(bào)告

細(xì)胞凋亡反應(yīng)中基因啟動(dòng)子發(fā)揮增強(qiáng)子功能調(diào)節(jié)基因表達(dá)

秦中勇1,2，石曉1,2，曹平平1,2，褚鷹1,2，管蔚4，楊楠1,3，程禾1,2，孫玉潔1,2

1. 南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇省人類功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211166 2. 南京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，南京 211166 3. 南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，南京 211166 4. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029

真核生物基因的轉(zhuǎn)錄受到近端啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的共同調(diào)控，部分基因的啟動(dòng)子可兼具有增強(qiáng)子的活性。與分別是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成員。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動(dòng)子與基因啟動(dòng)子在染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)上存在相互作用，且基因啟動(dòng)子區(qū)兼有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子特征性的組蛋白修飾標(biāo)記。為進(jìn)一步探究啟動(dòng)子是否具有增強(qiáng)子活性、能否在細(xì)胞凋亡過程中作為增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)，本研究利用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(chromosome conformation capture, 3C)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和熒光素酶報(bào)告基因等檢測技術(shù)在喜樹堿誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡模型中證實(shí)，啟動(dòng)子兼具增強(qiáng)子活性,并可通過形成染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)程調(diào)控基因表達(dá)。啟動(dòng)子的調(diào)控屬性與凋亡信號強(qiáng)弱密切相關(guān)，在較弱凋亡信號刺激下(1 μmol/L喜樹堿處理)，啟動(dòng)子主要發(fā)揮增強(qiáng)子功能；隨著凋亡刺激信號的加強(qiáng)(10 μmol/L喜樹堿處理)，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，主要調(diào)控其基因自身的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性的動(dòng)態(tài)變化與其組蛋白修飾標(biāo)志一致。本研究為進(jìn)一步探討B(tài)CL2家族成員對細(xì)胞凋亡刺激做出協(xié)同反應(yīng)的機(jī)制提供了新的線索。

啟動(dòng)子；增強(qiáng)子；雙重調(diào)控功能；基因；細(xì)胞凋亡

真核生物中基因轉(zhuǎn)錄是非常復(fù)雜的過程，反式作用因子需要通過識別各種類型的DNA調(diào)控序列來實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子是最具代表性也是研究最廣泛的兩類順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件[1~4]。啟動(dòng)子通常定位于基因的5?末端，包含TATA盒、下游核心啟動(dòng)子等元件組分，可以與RNA聚合酶II (RNAP II)結(jié)合，并確定轉(zhuǎn)錄起始位置和方向[5,6]。增強(qiáng)子大多具有組織或細(xì)胞特異性，可以在遠(yuǎn)端通過形成染色質(zhì)環(huán)的方式與靶基因啟動(dòng)子充分接近，協(xié)助靶啟動(dòng)子募集轉(zhuǎn)錄因子和輔轉(zhuǎn)錄因子，從而加速靶基因的轉(zhuǎn)錄，以確?；蛟跁r(shí)間空間上正確表達(dá)[7~9]。

區(qū)別增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的主要依據(jù)它們相對于基因5?末端的位置以及特異性組蛋白修飾的富集[1,10,11]。從所在位置來看，增強(qiáng)子具有激活遠(yuǎn)端啟動(dòng)子的特性，而與其靶基因的位置和方向無關(guān)，啟動(dòng)子則只能啟動(dòng)近端基因轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可以通過區(qū)域內(nèi)特異性的組蛋白修飾來進(jìn)行預(yù)測和分析，活性增強(qiáng)子通常富含組蛋白H3 Lys4的一甲基化(H3K4me1)和組蛋白H3 Lys27乙?；?H3K27ac)修飾[12~15]，啟動(dòng)子則通常表現(xiàn)為組蛋白H3 Lys4的三甲基化(H3K4me3)修飾。因此，H3K27ac的存在伴隨著高水平的H3K4me1和低水平的H3K4me3被視作活性增強(qiáng)子的標(biāo)志。具有增強(qiáng)子功能的啟動(dòng)子兼有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子特征性的組蛋白修飾，并與其他啟動(dòng)子形成遠(yuǎn)距離的相互作用[4,16]。雖然通過高通量的方法，越來越多的增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子被鑒定了出來，然而對其生物學(xué)功能的探究甚少[16~18]，研究增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子在特定生理病理?xiàng)l件下發(fā)揮的功能和調(diào)控方式可以幫助人們?nèi)嬲J(rèn)識轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

和基因定位于人18號染色體上，所編碼的蛋白分別為BCL2蛋白家族重要的促凋亡和抗凋亡成員[19~23]。BCL2蛋白家族抗凋亡成員包括BCL-2、BCL-W、A1等，促凋亡成員又分為凋亡效應(yīng)物(Bax、Bak)和凋亡激活物(Bim、Bid、Puma、NOXA等)，各個(gè)成員轉(zhuǎn)錄水平在正常生理狀態(tài)下的比例維持穩(wěn)定，精密調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。一旦細(xì)胞受到凋亡信號的刺激，如藥物暴露、營養(yǎng)條件匱乏、氧化應(yīng)激等刺激因素會(huì)打破兩種基因的轉(zhuǎn)錄平衡[19,24,25]，抗凋亡成員如的基因水平會(huì)被下調(diào)，而凋亡激活成員等會(huì)過度表達(dá)激活凋亡效應(yīng)物的寡聚化，寡聚化的凋亡效應(yīng)物會(huì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜進(jìn)行穿孔，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase途徑的細(xì)胞凋亡。

本課題組前期在Jurkat細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)與基因均可被增強(qiáng)子mbr通過形成染色質(zhì)環(huán)的方式所調(diào)控，而啟動(dòng)子與啟動(dòng)子存在空間上的相互作用，敲除mbr后兩啟動(dòng)子的相互作用依然存在[26~30]。無獨(dú)有偶，在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中本課題組也檢測到了和啟動(dòng)子的相互作用，同時(shí)在數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)兼具啟動(dòng)子和增強(qiáng)子特征性的組蛋白修飾。這一有趣的現(xiàn)象激發(fā)了對啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄元件屬性和BCL2家族基因調(diào)控新機(jī)制的思考。因此，本研究旨在探究啟動(dòng)子是否具有增強(qiáng)子活性、能否作為增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)及什么情況下發(fā)揮增強(qiáng)子功能。這對認(rèn)識基因調(diào)控元件屬性切換的條件和意義將有新的啟發(fā)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購買自美國ATCC細(xì)胞庫。

MCF-10A所用培養(yǎng)液為DMEM-F12培養(yǎng)基，并添加終濃度為5%的馬血清和4種生長因子(濃度為0.02 μg/mL EGF生長因子、10 μg/mL胰島素、0.5 μg/mL氫化可地松、0.1 μg/mL霍亂毒素)以及兩種抗生素：100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。MCF-7所用培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)基，并添加終濃度為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素以及0.2 U/mL胰島素。上述兩種細(xì)胞在CO2濃度為5%、溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 載體構(gòu)建

利用GenBank數(shù)據(jù)庫查詢、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000 bp至下游500 bp的序列為基因的啟動(dòng)子區(qū)，利用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)合適的PCR引物，并選擇合適的酶切位點(diǎn)。將PCR片段插入到pGL3-basic質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因上游檢測啟動(dòng)子活性，插入pGL3-promoter質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因下游檢測增強(qiáng)子活性，所用PCR片段與相應(yīng)質(zhì)粒使用同種限制酶切割，利用清潔回收試劑盒(廣州美基生物)純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中，隨后挑取單菌落擴(kuò)增，鑒定陽性克隆。

1.3 細(xì)胞凋亡模型

取處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞，接種于6孔板和24孔板中，培養(yǎng)24 h后用不同濃度(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μmol/L) 的喜樹堿(camptothecin, CPT)處理10 h后，收取細(xì)胞，分別檢測、基因的RNA水平以及各個(gè)喜樹堿濃度下的細(xì)胞凋亡水平；同時(shí)將空載的對照組質(zhì)粒、重構(gòu)的pGL3-basic、pGL3-promoter質(zhì)粒分別與內(nèi)參海腎熒光素酶熒光素酶質(zhì)粒pRL-SV40按質(zhì)量比為1000∶1的比例，利用脂質(zhì)體Lipfectamine 3000 (Thermo Fisher，美國)共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，4~6 h后用上述濃度梯度的喜樹堿處理相同時(shí)間(10 h)，檢測各濃度喜樹堿下的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性。綜合分析細(xì)胞凋亡程度、和的RNA變化水平以及啟動(dòng)子不同方面的轉(zhuǎn)錄元件活性。

1.4 RNA提取和 qRT-PCR

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，利用試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，各個(gè)樣品取500 ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，按1∶10稀釋比例稀釋各組cDNA，以稀釋后的cDNA為模板，配制SYBR Green I Master Mix體系(Roche，瑞士)，使用Light Cycler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)檢測、以及內(nèi)參基因的表達(dá)變化，所用引物如下，RT-NOXA- F：5?-GCAGAGCTGGAAGTCG-AGTGT-3?；RT-NOXA- R：5?-CTCTTTTGAAGGA-GTCCCCTCAT-3?；RT-BCL2- F：5?-TCGCCCTGTGG-ATGACTGAG-3?；RT-BCL2- R：5?-CAGAGTCTTCA-GAGACAGCCAGGA-3?；RT- β-Actin-F：5?-TCATGA-AGTGTGACGTGGACAT-3?；RT-β-Actin-R：5?-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG- 3?。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s；35個(gè)循環(huán)，采用2–ΔΔCt法分析定量PCR數(shù)據(jù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

使用凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司)檢測細(xì)胞凋亡。每組收集1×105個(gè)細(xì)胞，洗滌并重懸，加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution避光、室溫孵育染色；隨后加入Binding Buffer，輕輕混勻，染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況(BD，美國)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長為488 nm；FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI的紅色熒光在FL3 通道檢測，每個(gè)樣本采集10000個(gè)細(xì)胞。用Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，F(xiàn)L1為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L3為縱坐標(biāo)，根據(jù)FITC和PI熒光值確定兩熒光參數(shù)陰陽界限，劃定十字門。其中細(xì)胞可分為三個(gè)亞群：活細(xì)胞為雙陰性(Annexin V-FITC–/PI–)；早期凋亡細(xì)胞為Annexin V-FITC單陽性(Annexin V-FITC+/PI–)；晚期凋亡細(xì)胞為Annexin V-FITC和PI雙陽性(Annexin V-FITC+/PI+)。

1.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immuno-precipitation, ChIP)

使用ChIP試劑盒(CST，美國)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集1×107個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞在室溫下用含1 %甲醛的培養(yǎng)基交聯(lián)固定10 min，接著用甘氨酸終止交聯(lián)，裂解細(xì)胞后用超聲破碎儀(SONICS，美國)將基因組DNA剪切成200~1000 bp的短片段，離心后取上清用ChIP Buffer稀釋分別用H3K4me1和H3K4me3抗體(Millipore，美國)在4℃孵育過夜。次日，加入磁珠4℃孵育2 h后進(jìn)行洗滌，之后在65℃水浴中解交聯(lián)、吸附柱純化DNA。最后取ChIP產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測啟動(dòng)子區(qū)H3K4me1和H3K4me3藥物處理前后的變化情況，所用引物為ChIP-F：5?- GTTGTTCTGAGGACGGAATG-3?；ChIP-R：5?-GCA-TAATGTTTGGCGAGGC-3?。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s；35個(gè)循環(huán)。以Input的Ct值作為校正值，采用2–ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.7 染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(chromosome conforma-tion capture, 3C)

收集1×106個(gè)細(xì)胞，用2 mL含2%甲醛的培養(yǎng)基，在室溫下交聯(lián)固定細(xì)胞5 min，用濃度為0.125 mol/L的甘氨酸終止交聯(lián)。隨后用1.25 mL 3C裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、pH=8.0、10 mmol/L NaCl、0.2% NP-40)在4℃條件下翻轉(zhuǎn)孵育60 min。之后進(jìn)行分步酶切：每管樣品加入135.2 μL ddH2O、20 μL NEB buffer、4.4 μL 10% SDS在37℃搖床中孵育1 h；加入32.4 μL濃度10%的Triton在37℃搖床中孵育1 h；再加入8 μLd Ⅲ 限制性內(nèi)切酶(NEB，美國)在37℃搖床中孵育過夜(22 h左右)；然后每管加入38 μL 10% SDS (終濃度1.6%) 65℃水浴20 min使酶失活；隨后取40 μL上一步酶切產(chǎn)物加入70 μL NEB Buffer、140 μL Triton、444 μL ddH2O進(jìn)行在16℃水浴中連接過夜。最后連接產(chǎn)物用酚氯仿抽提純化，取200 ng DNA為模板，用以下4條引物引物A：5?-GTCTAAGAGTAGCTCCTGTA-3?；引物B：5?-CTAAATCTAAACAGAGAACCCA-3?；引物C：5?-GTTTGAGAATGATGAATGATTTG-3?；引物D：5?-TAACATTCCTTCTGTGCTGCTA-3?的不同組合來擴(kuò)增3C產(chǎn)物，Loading control擴(kuò)增的序列不含所選酶切位點(diǎn)，以檢測基因組DNA的完整性，所用引物為：Loading control-F：5?-GAAATCGTG-CGTGACATTAA-3?；Loading control-R：5?-AAGG-AAGGCTGGAAGAGTG-3?，上述PCR采用Hot Star (Qiagen，德國)體系擴(kuò)增。

1.8 雙熒光素酶活性檢測

本實(shí)驗(yàn)采用Dual Luciferase Reporter Assay Kit (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行，收取24孔板中的細(xì)胞，每孔加入100 μL 1×Cell Lysis Buffer，室溫條件下裂解5~ 10 min后，吹打并吸取全部細(xì)胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL EP管中，常溫下12,000離心5 min，取上清用于后續(xù)檢測。向100 μL Luciferase Substrate中加入20 μL上清，檢測螢火蟲熒光素酶讀值，記為RLU1，隨后加入100 μL經(jīng)Stop & Reaction Buffer稀釋的1× Renilla Substrate，該步操作可以終止螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)并起始海腎熒光素酶的反應(yīng)，將海腎熒光素酶的檢測讀值記為RLU2，計(jì)算每個(gè)樣品RLU1/ RLU2的比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SEM)表示。組間比較用雙尾檢驗(yàn)并計(jì)算值，*表示<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**表示<0.01，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NOXA基因的啟動(dòng)子具有增強(qiáng)子活性

通過查詢UCSC數(shù)據(jù)庫[31]啟動(dòng)子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)組蛋白ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)兼有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子特征性的組蛋白修飾的標(biāo)記H3K4me1、H3K4me3以及H3K27ac (圖1A)，提示其可能為增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子。利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，分別構(gòu)建不同類型的報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MCF-7中檢測這兩個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄元件活性[32,33]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，啟動(dòng)子和啟動(dòng)子均能起始熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄(圖1B)；而啟動(dòng)子兼具增強(qiáng)子活性，啟動(dòng)子則未檢測到增強(qiáng)子活性；為了進(jìn)一步驗(yàn)證啟動(dòng)子作為增強(qiáng)子時(shí)是否具有方向性，將啟動(dòng)子序列翻轉(zhuǎn)后插入pGL3-promoter質(zhì)粒報(bào)告基因的下游，結(jié)果并未檢測到熒光強(qiáng)度上調(diào)(圖1C)。結(jié)果表明，與經(jīng)典增強(qiáng)子有所不同，啟動(dòng)子發(fā)揮增強(qiáng)子功能時(shí)有方向效應(yīng)，序列翻轉(zhuǎn)后增強(qiáng)子活性消失。

2.2 NOXA啟動(dòng)子與BCL2啟動(dòng)子存在相互作用

本課題組前期在Jurkat細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子與基因啟動(dòng)子存在空間上的相互作用，為

了驗(yàn)證在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的情況，本研究開展了3C實(shí)驗(yàn)[34~36]。實(shí)驗(yàn)原理及引物設(shè)計(jì)如圖2A所示，即細(xì)胞在甲醛交聯(lián)狀態(tài)下，利用限制性內(nèi)切酶d Ⅲ進(jìn)行切割后，再利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，如果兩啟動(dòng)子序列在空間上足夠接近，則可被分別設(shè)計(jì)在序列兩端的單向引物的組合而擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用位于啟動(dòng)子的上游的引物A和位于啟動(dòng)子下游的引物C組合可成功擴(kuò)增出217 bp的PCR的產(chǎn)物(圖2B)。對此PCR產(chǎn)物的DNA測序結(jié)果證實(shí)產(chǎn)物DNA序列一部分來自基因啟動(dòng)子，另一部分來自基因啟動(dòng)子(圖2C)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示啟動(dòng)子與啟動(dòng)子可以形成染色質(zhì)環(huán)，從而在空間上靠近。結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示啟動(dòng)子可能作為增強(qiáng)子調(diào)控的表達(dá)。

2.3 NOXA啟動(dòng)子作為增強(qiáng)子激活BCL2啟動(dòng)子

為驗(yàn)證啟動(dòng)子對啟動(dòng)子的調(diào)控作用，構(gòu)建了不同類型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將基因啟動(dòng)子插入至報(bào)告基因上游，發(fā)揮啟動(dòng)子的作用；將啟動(dòng)子插入至報(bào)告基因的下游，驗(yàn)證其是否可以作為增強(qiáng)子促進(jìn)上調(diào)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(圖3A)。結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中，啟動(dòng)子位于熒光素酶報(bào)告基因下游時(shí)，未檢測到報(bào)告基因的表達(dá)(圖3B，②)，排除了啟動(dòng)子反向激活報(bào)告基因的情況[37~39]。當(dāng)啟動(dòng)子位于報(bào)告基因上游，啟動(dòng)子位于熒光素酶報(bào)告基因下游時(shí)(圖3B，④)，報(bào)告基因的活性比上游僅存在啟動(dòng)子時(shí)(圖3B，③)上調(diào)了2.5倍左右，也即說明啟動(dòng)子可以作為增強(qiáng)子促進(jìn)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，結(jié)合3C的結(jié)果可以說明啟動(dòng)子可作為增強(qiáng)子調(diào)控基因。

2.4 喜樹堿誘導(dǎo)NOXA基因的啟動(dòng)子向增強(qiáng)子轉(zhuǎn)變

喜樹堿是重要的抗腫瘤藥物[40,41]，通過靶向抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I[42]，引起細(xì)胞內(nèi)DNA不可逆損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)[40]。為建立紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型，分別用低濃度(1 μmol/L)和高濃度(10μmol/L)喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞10 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示用1 μmol/L和10 μmol/L喜樹堿處理時(shí)MCF-7細(xì)胞凋亡比例分別為6.6%和11.5% (圖4A)。同步檢測NOXA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄元件活性，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子活性在1 μmol/L喜樹堿刺激時(shí)處于最高水平，此時(shí)啟動(dòng)子活性無明顯變化；10 μmol/L喜樹堿處理細(xì)胞時(shí)啟動(dòng)子活性最強(qiáng)而增強(qiáng)子活性弱(圖4，B和C)。同時(shí)依據(jù)ENCODE數(shù)據(jù)庫[43]MCF-7細(xì)胞中特征性的組蛋白修飾峰圖設(shè)計(jì)ChIP引物(圖4D)，檢測基因啟動(dòng)子區(qū)的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子特征性組蛋白修飾標(biāo)記H3K4me1和H3K4me3的變化(圖4，E和F)，用H3K4me1/H3K4me3的比值來表征基因組上啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄元件屬性，結(jié)果顯示1 μmol/L喜樹堿處理時(shí)H3K4me1/ H3K4me3的比值最高，此時(shí)啟動(dòng)子主要作為增強(qiáng)子發(fā)揮作用，而10 μmol/L喜樹堿處理時(shí)H3K4me1/H3K4me3的比值最低，啟動(dòng)子發(fā)揮啟動(dòng)子本身的作用(圖4G)。這與上述報(bào)告基因中得到啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性的變化結(jié)果是一致的。我們推斷用1 μmol/L和10 μmol/L喜樹堿處理細(xì)胞時(shí)，啟動(dòng)子發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄元件的屬性不同。在平行實(shí)驗(yàn)中，本研究利用qRT-PCR分析了和基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在不同藥物濃度的處理下，的濃度均有下降，但在1 μmol/L喜樹堿處理時(shí)，即啟動(dòng)子的增強(qiáng)子活性最強(qiáng)的時(shí)候，下降幅度最小，而用10 μmol/L喜樹堿處理時(shí)，即啟動(dòng)子活性最強(qiáng)時(shí)，下降幅度較大，而此時(shí)mRNA處于最高水平。這些結(jié)果提示啟動(dòng)子在低濃度藥物下可作為增強(qiáng)子調(diào)控，高濃度喜樹堿刺激下主要作為啟動(dòng)子起始自身基因的表達(dá)(圖4，H和I)，進(jìn)一步證實(shí)了啟動(dòng)子作為增強(qiáng)子對的調(diào)控作用。

圖1 分析和鑒定NOXA基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子活性

A：UCSC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示的基因啟動(dòng)子區(qū)(上圖)和基因啟動(dòng)子區(qū)(下圖)的組蛋白H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac修飾特征。B：啟動(dòng)子活性驗(yàn)證。將啟動(dòng)子和啟動(dòng)子分別插入至pGL3-basic熒光素酶基因上游后轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-10A、MCF-7細(xì)胞中(對照為pGL3-basic空載質(zhì)粒)，驗(yàn)證二者的啟動(dòng)子活性；C：增強(qiáng)子活性驗(yàn)證。將啟動(dòng)子和啟動(dòng)子分別插入至pGL3-promoter熒光素酶基因下游后轉(zhuǎn)染MCF-10A和MCF-7細(xì)胞(對照為pGL3-promoter空載質(zhì)粒)，檢測二者的增強(qiáng)子活性，結(jié)果顯示啟動(dòng)子兼具有增強(qiáng)子活性。D：翻轉(zhuǎn)啟動(dòng)子后增強(qiáng)子活性驗(yàn)證。將啟動(dòng)子翻轉(zhuǎn)后插入至pGL3-promoter熒光素酶基因下游后轉(zhuǎn)染MCF-10A和MCF-7細(xì)胞(對照為pGL3-promoter空載質(zhì)粒)，檢測啟動(dòng)子翻轉(zhuǎn)后的增強(qiáng)子活性。*：<0.05；**：<0.01。

圖2 3C證明NOXA啟動(dòng)子與BCL2啟動(dòng)子存在空間互作

A：基因與基因的相對位置示意圖。染色質(zhì)構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)的原理以及所用的酶切位點(diǎn)和引物位置。黑色倒三角表示d Ⅲ限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)、白色空心箭頭表示引物設(shè)計(jì)的位置及其擴(kuò)增方向、紅色標(biāo)注的是啟動(dòng)子區(qū)、綠色標(biāo)注的序列為啟動(dòng)子區(qū)。B：MCF-7細(xì)胞中的3C結(jié)果。上方DNA瓊脂糖凝膠電泳圖從左至右泳道依次為DNA Marker、交聯(lián)連接、交聯(lián)不連接、不交聯(lián)連接、不交聯(lián)不連接的3C產(chǎn)物PCR結(jié)果，交聯(lián)且連接處的條帶由引物A和引物C組合擴(kuò)增產(chǎn)生。C：實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物TA克隆后進(jìn)行Sanger測序結(jié)果。

圖3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)NOXA啟動(dòng)子對BCL2啟動(dòng)子的增強(qiáng)子效應(yīng)

A：不同類型的報(bào)告基因質(zhì)粒模式圖。分別顯示各調(diào)控序列與報(bào)告基因的相對位置以及兩個(gè)調(diào)控序列間的相對位置。當(dāng)位于報(bào)告基因下游的調(diào)控序列具有增強(qiáng)子活性時(shí)，可增強(qiáng)上游基因啟動(dòng)子的活性。B：熒光素酶報(bào)告基因活性檢測。分別將上述報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，檢測其熒光素酶報(bào)告基因的活性所得結(jié)果，以確定基因啟動(dòng)子序列對基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子效應(yīng)。**：<0.01。

3 討論

本研究以和基因啟動(dòng)子間的相互作用為切入點(diǎn)，鑒定了一個(gè)新的具有增強(qiáng)子功能的啟動(dòng)子—啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可通過形成染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)程調(diào)控基因表達(dá)。啟動(dòng)子的調(diào)控屬性與凋亡信號強(qiáng)弱密切相關(guān)，在較弱凋亡信號刺激下(1 μmol/L喜樹堿處理)，啟動(dòng)子主要發(fā)揮增強(qiáng)子功能，隨著凋亡刺激信號的加強(qiáng)(10 μmol/L喜樹堿處理)，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，主要調(diào)控其基因自身的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

在喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型中，細(xì)胞中的mRNA水平是呈藥物濃度依賴性的下降，即藥物濃度越高的轉(zhuǎn)錄水平下降越多，結(jié)合啟動(dòng)子表現(xiàn)出的增強(qiáng)子活性變化情況，我們推測這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于細(xì)胞在應(yīng)對不同程度的凋亡刺激時(shí)產(chǎn)生的不同反應(yīng)。當(dāng)輕微凋亡刺激時(shí)，促凋亡基因啟動(dòng)子活性較低，表達(dá)水平不高，而與此同時(shí)啟動(dòng)子表現(xiàn)較高增強(qiáng)子水平，使本該急劇下降的抗凋亡基因表達(dá)只有輕微下降；當(dāng)強(qiáng)烈的凋亡刺激作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡不可挽回，此時(shí)啟動(dòng)子活性升高，其增強(qiáng)子活性降低，導(dǎo)致表達(dá)水平上升，表達(dá)水平進(jìn)一步下降，細(xì)胞走向凋亡[19,21,44,45]。啟動(dòng)子作為的增強(qiáng)子在這里以一種“剎車機(jī)制”來發(fā)揮增強(qiáng)子作用，因其不是激活的表達(dá)而是拮抗的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。本研究揭示了啟動(dòng)子作為增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子參與了細(xì)胞凋亡進(jìn)程，在發(fā)揮啟動(dòng)子或增強(qiáng)子功能時(shí)受不同強(qiáng)弱凋亡信號的調(diào)節(jié)，對認(rèn)識基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的轉(zhuǎn)換和激活的調(diào)控機(jī)制及在生物學(xué)進(jìn)程中的意義有新的啟發(fā)。有意思的是基因啟動(dòng)子作為增強(qiáng)子時(shí)所調(diào)控的靶基因是同家族中與其蛋白功能相互拮抗的成員，這有助于人們更好地了解BCL2家族各成員之間的聯(lián)系，為進(jìn)一步探討B(tài)CL2家族成員對細(xì)胞凋亡刺激做出協(xié)同反應(yīng)的機(jī)制提供了新的線索。

圖4 喜樹堿誘導(dǎo)NOXA基因啟動(dòng)子向增強(qiáng)子轉(zhuǎn)變

A：喜樹堿處理后各組凋亡情況。分別以低濃度(1μmol/L)和高濃度(10μmol/L)喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞10 h，收獲細(xì)胞后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。B和C：利用報(bào)告基因系統(tǒng)分別檢測不同濃度喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞后10 h后，NOXA基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性變化。D：ENCODE數(shù)據(jù)庫中的MCF-7細(xì)胞H3K4me1和H3K4me3修飾的ChIP-seq數(shù)據(jù)。紅框圈出的部分為H3K4me1和H3K4me3組蛋白修飾重疊區(qū)域，在該部分設(shè)計(jì)合適的ChIP引物。E和F：利用ChIP驗(yàn)證不同濃度喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞后啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾H3K4me1和H3K4me3的變化。G：ChIP數(shù)據(jù)H3K4me1/H3K4me3的比值變化。H：喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞基因的mRNA水平變化。I：喜樹堿處理MCF-7細(xì)胞基因的mRNA水平變化。*：<0.05；**：<0.01。

細(xì)胞特異性染色質(zhì)相互作用可以為細(xì)胞特異性的基因轉(zhuǎn)錄提供構(gòu)象上的支持[33]。本課題組在多種細(xì)胞(MCF-7、MCF-10A、Jurkat細(xì)胞)均檢測到了啟動(dòng)子與啟動(dòng)子在空間上的相互作用，并且在上述細(xì)胞中同時(shí)檢測到了基因啟動(dòng)子兼具增強(qiáng)子活性，證明該種調(diào)控方式并不存在正?；蚰[瘤細(xì)胞特異性，暗示兩者通過轉(zhuǎn)錄元件的調(diào)控是一種通用型轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。

增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子通過與靶基因啟動(dòng)子在空間上的相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[46,47]，兩者空間上的接近很可能是通過引入關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，如ZNF143或YY1[48]，據(jù)已有報(bào)道這兩個(gè)因子參與了染色質(zhì)環(huán)的形成，并在增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子上有著高豐度的結(jié)合[16,17]。本研究雖然初步探索了啟動(dòng)子向增強(qiáng)子轉(zhuǎn)變的條件，但并未找到驅(qū)動(dòng)這種轉(zhuǎn)變的機(jī)制，具體的轉(zhuǎn)變機(jī)制是未來需要進(jìn)一步探討的。值得注意的是，有文獻(xiàn)報(bào)道在前列腺癌中長非編碼RNA的截短異構(gòu)體的啟動(dòng)子同時(shí)也是一個(gè)增強(qiáng)子[17]，作為增強(qiáng)子時(shí)調(diào)控全長異構(gòu)體的表達(dá)，而該啟動(dòng)子向增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換的因素是一個(gè)SNP，該SNP的不同風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)介導(dǎo)了不同的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而決定了SNP所在區(qū)域是啟動(dòng)子還是增強(qiáng)子，這說明啟動(dòng)子向增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)變很可能是由于一種或多種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的，這是目前極少數(shù)涉及同一序列在啟動(dòng)子與增強(qiáng)子之間轉(zhuǎn)換機(jī)制的報(bào)道。已有文獻(xiàn)報(bào)道增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量比普通啟動(dòng)子大，其種類也有所不同，這引發(fā)人們聯(lián)想，是否在不同生理狀態(tài)或刺激下增強(qiáng)子樣啟動(dòng)子如啟動(dòng)子可選擇性結(jié)合不同的轉(zhuǎn)錄因子從而實(shí)現(xiàn)其在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子間的轉(zhuǎn)換？本課題組將細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SATB1在MCF-7細(xì)胞中過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性無明顯變化，而啟動(dòng)子的增強(qiáng)子活性卻大幅度增加(結(jié)果未列出)，說明SATB1參與了啟動(dòng)子向增強(qiáng)子轉(zhuǎn)化的過程，但是否為轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)因素其具體機(jī)制如何則需要進(jìn)一步的證明。

本研究工作為進(jìn)一步探討B(tài)CL2蛋白家族成員對細(xì)胞凋亡刺激做出協(xié)同反應(yīng)的機(jī)制提供了新的線索。

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Thepromoter could function as an active enhancer to regulate the expression ofin the apoptosis response

Zhongyong Qin1,2, Xiao Shi1,2, Pingping Cao1,2, Ying Chu1,2, Wei Guan4, Nan Yang1,3, He Cheng1,2, Yujie Sun1,2

The transcription of eukaryotic genes is regulated by both proximal promoters and distal enhancers. Some promoters also have enhancer activity.andare pro-apoptotic and anti-apoptotic members of the BCL2 family of protein, respectively. Our previous study has found that thegene promoter and thegene promoter interact at the level of three-dimensional chromatin structure. Moreover, thegene promoter region displays histone modifica-tions characteristic of both promoters and enhancers. This study aimed to explore whether and when thepromoter could act as an active enhancer to regulateexpression. Based on the apoptosis model of MCF-7 cells induced by camptothecin, we used chromosome conformation capture (3C), quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and the luciferase reporter gene technology to demonstrate that thepromoter could function as an active enhancer and physically interact with thepromoter through chromatin looping. The regulatory properties of thepromoter were closely related to the strength of the apoptosis stimulation. Under weak apoptotic stimulation (1 μmol/L camptothecin treatment), thepromoter mainly functioned as an enhancer; with the enhancement of apoptotic stimulation (10 μmol/L camptothecin treatment), thepromoter activity increased and mainly regulated the expression of the gene itself to promote apoptosis.Chromatin immunoprecipitation (ChIP) confirmed that the dynamic changes of the promoter activity and enhancer activity in the NOXA promoter region are consistent with its histone modification marks. This study provides new clues for further exploring the mechanism underlying cooperative response offamily member to apoptosis stimuli.

promoter; enhancer;dual transcription regulation function;gene; apoptosis

2020-07-07;

2020-10-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81172091，81572789)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81172091,81572789)]

秦中勇，碩士，專業(yè)方向：基因遠(yuǎn)程調(diào)控。E-mail: qinzhongyong1994@163.com

孫玉潔，博士，教授，研究方向：增強(qiáng)子生物學(xué)功能、腫瘤耐藥形成機(jī)制。E-mail: yujiesun@njmu.edu.cn

程禾，博士，講師，研究方向：乳腺癌耐藥形成機(jī)制。E-mail: chenghe@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-213

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201106.1053.005.html

URI: 2020/11/9 10:47:50

(責(zé)任編委: 方向東)