響應(yīng)面優(yōu)化可溶態(tài)和膜結(jié)合態(tài)馬鈴薯多酚氧化酶提取工藝

李 俊,章潔瓊,劉 輝,劉永翔,3,王 輝,盧 揚(yáng),*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所,貴州貴陽(yáng) 550006;2.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站,貴州貴陽(yáng) 550001;3.貴州省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550006)

作為繼小麥、水稻、玉米之后的世界第四大糧食作物,馬鈴薯具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)全面及綜合加工用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)[1]。馬鈴薯去皮以后易發(fā)生褐變,導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)、色澤和風(fēng)味下降,這是馬鈴薯加工面臨的一大難題[2]。同時(shí),有研究表明,全世界每年因褐變?cè)斐傻墓邠p失占總損失的一半以上,且以多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)引起的酶促褐變?yōu)橹?有關(guān)酶促褐變的研究也一直是果蔬采后加工研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。酶促褐變是指果蔬組織中的酚類(lèi)物質(zhì)在PPO等的作用下氧化成醌,醌再經(jīng)聚合形成褐色物質(zhì)的過(guò)程[4]。

PPO在植物細(xì)胞內(nèi)有兩種存在形式:可溶態(tài)(sPPO)存在于細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)體中,膜結(jié)合形態(tài)(mPPO)存在于質(zhì)體、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器膜上[5]。研究表明,PPO在大多數(shù)水果中主要以膜結(jié)合態(tài)存在,如蘋(píng)果中sPPO只占8%～15%[6]。但是有研究發(fā)現(xiàn),sPPO在褐變過(guò)程中起主要作用,通常情況下,細(xì)胞內(nèi)mPPO活性較低,在外界環(huán)境或人為處理下,可激發(fā)其活性,如利用非熱加工技術(shù),在某一范圍壓力作用下,導(dǎo)致細(xì)胞膜被損壞或膜的通透性發(fā)生改變,使細(xì)胞內(nèi)部的PPO泄露出來(lái),或者使被束縛在細(xì)胞碎片上的酶釋放出來(lái),使PPO酶活提高[7],表明mPPO與sPPO在酶促褐變機(jī)理研究中的同等重要性。由于mPPO的存在,使PPO結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、褐變機(jī)理的問(wèn)題研究起來(lái)十分復(fù)雜。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外關(guān)于sPPO的提取分離報(bào)道較多,而關(guān)于mPPO的研究報(bào)道較少。PPO的提取方法主要有丙酮提取、丙酮粉提取、超聲波輔助浸提、超高壓提取、緩沖溶液浸提等[8],這些方法提取出的主要是sPPO,而mPPO與植物細(xì)胞結(jié)合更加緊密,所以提取方法不同于sPPO。李曉麗等[9]對(duì)比了丙酮提取法、超聲波輔助浸提法和緩沖溶液浸提法對(duì)無(wú)核白葡萄PPO的提取效果,發(fā)現(xiàn)緩沖溶液提取法的效果最佳。劉芳[10]對(duì)富士蘋(píng)果sPPO和mPPO特性進(jìn)行對(duì)比,采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶提取sPPO,采用Tris-HCl緩沖溶液提取mPPO,對(duì)比發(fā)現(xiàn)mPPO活性是sPPO的34.12倍。緩沖液浸提法是一種液-固萃取方法,因此緩沖液對(duì)提取效果影響很大[11]。常用的緩沖溶液以磷酸鹽為基底,采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)結(jié)合吐溫-80(Tween-80)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、抗壞血酸(VC)中的一種或幾種配制而成[12-13]。由于mPPO和sPPO性質(zhì)的差異,提取方法會(huì)直接影響到提取效果,且將馬鈴薯sPPO和mPPO區(qū)分提取的研究報(bào)道極少。

因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)緩沖溶液浸提法對(duì)sPPO進(jìn)行提取,通過(guò)超聲波輔助緩沖溶液提取法對(duì)mPPO進(jìn)行提取,并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)兩種PPO的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為有效解決馬鈴薯加工過(guò)程中的酶促褐變提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大西洋馬鈴薯(SolanumtuberosumL.) 由貴州省馬鈴薯研究所提供;牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、考馬斯亮蘭G-250、鄰苯二酚等均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2102C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼科上海儀器有限公司;G-040s型超聲波清洗機(jī) 深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司;CR21G III型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;HHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 可溶態(tài)多酚氧化酶(sPPO)提取實(shí)驗(yàn)

1.2.1 提取工藝 取新鮮馬鈴薯20 g,依次加入3 g PVP、預(yù)冷的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L),冰浴研磨均勻,置于4 ℃冰箱中浸提。浸提液于4 ℃、12000 r/min離心30 min后,取上清液,得sPPO粗酶液。

1.2.2 sPPO提取的單因素實(shí)驗(yàn) 基于sPPO提取方法,設(shè)定提取的單因素實(shí)驗(yàn)條件為:固定浸提時(shí)間為6 h,緩沖液pH為7.0,料液比分別(質(zhì)量體積比,w/v)為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6;固定料液比為1∶4,緩沖液pH為7.0,浸提時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18 h;固定料液比為1∶4,浸提時(shí)間為6 h,緩沖液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。考察料液比、浸提時(shí)間、緩沖液pH對(duì)sPPO提取效果的影響。

1.2.3 sPPO提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)sPPO比活力有影響的三個(gè)因素料液比、浸提時(shí)間、緩沖液pH進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),優(yōu)化sPPO的提取工藝。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素水平

1.3 膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶(mPPO)提取實(shí)驗(yàn)

1.3.1 提取工藝 在sPPO提取后的殘?jiān)屑尤隩ris-HCl緩沖液和0.25% Triton X-100,勻漿后在4 ℃冰箱中靜置4 h。在功率80 W、溫度4 ℃條件下超聲提取,然后4 ℃下11000 r/min離心15 min。在4 ℃冰箱中靜置30 min,然后35 ℃水浴保溫15 min。25 ℃下11000 r/min離心15 min,取上清液,得mPPO粗酶液。

1.3.2 mPPO提取的單因素實(shí)驗(yàn) 基于mPPO提取方法,設(shè)定提取的單因素實(shí)驗(yàn)條件為:固定超聲提取時(shí)間為5 h,緩沖液pH為6.0,料液比(質(zhì)量體積比,w/v)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6;固定料液比為1∶4,緩沖液pH為6.0,超聲提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 h,超聲提取過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水浴溫度,通過(guò)不斷添加冰水的方式控制水浴溫度在4±0.5 ℃;固定料液比為1∶4,超聲提取時(shí)間為5 h,Tris-HCl緩沖液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0?？疾炝弦罕取⒊晻r(shí)間、緩沖液pH對(duì)mPPO提取的影響。

1.3.3 mPPO提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)mPPO比活力有影響的三個(gè)因素料液比、超聲時(shí)間、緩沖液pH進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),優(yōu)化mPPO的提取工藝。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素水平

1.4 多酚氧化酶活力與比活力測(cè)定

取0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)2.5 mL于1 cm比色皿中,加入0.1 mol/L鄰苯二酚溶液0.2 mL,PPO粗酶液0.3 mL,混勻后在416 nm處比色,酶液加入后開(kāi)始記時(shí),每40 s記錄1次OD隨時(shí)間的變化值,以最初直線(xiàn)段的斜率(ΔOD/t)計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位定義為:在測(cè)定條件下,每分鐘催化1 μmol/L鄰苯二酚為醌所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)按ε=3700 L·mol-1·cm-1計(jì)算[10,14]。按公式(1)計(jì)算粗酶液PPO活力:

式(1)

其中:M代表酶活力(U/mL);N代表酶液稀釋倍數(shù);V總代表PPO酶活測(cè)定反應(yīng)體系的終體積(mL);V酶代表反應(yīng)添加的酶液體積(mL);ΔOD416代表t時(shí)間內(nèi)反應(yīng)液在416 nm處吸光度的增加值;ε代表416 nm處鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二醌的摩爾吸光系數(shù)(L/mol·cm);t代表反應(yīng)時(shí)間(min);L代表比色皿的直徑(cm)。

提取出的sPPO和mPPO粗酶液中酶蛋白濃度不同,酶活性差別受樣品酶蛋白濃度影響較大,所以采用酶比活力表示樣品間酶活性差別。酶比活力為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力數(shù),按公式(2)計(jì)算粗酶液PPO比活力:

式(2)

其中:H代表酶比活力(U/mg);M代表酶活力(U/mL);C代表酶蛋白濃度(mg/mL)。

1.5 PPO粗酶液中蛋白濃度測(cè)定

參照Bradford[15]的方法測(cè)定粗酶液蛋白濃度。取不同濃度牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL,加入10 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,搖勻后室溫放置5 min,以空白溶液作為對(duì)照,用1 cm比色皿在595 nm處測(cè)定吸光值。以酶蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)X,吸光值為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:Y=1.8385X+0.1611,R2=0.9990。樣品測(cè)定按照上述步驟操作,平行測(cè)定3次,取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin(Version 8.6)作圖,Design-Expert(Version 8.0)進(jìn)行響應(yīng)面分析,SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異,P<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 sPPO提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可知,隨著料液比比例增加,sPPO的比活力顯著升高(P<0.05),當(dāng)料液比達(dá)到1∶3時(shí),sPPO比活力達(dá)到最大值,繼續(xù)增加料液比,會(huì)使sPPO比活力緩慢降低。原因可能是料液比過(guò)低,使馬鈴薯中sPPO無(wú)法充分溶出,提取不充分,導(dǎo)致sPPO比活力會(huì)隨著料液比增加而升高,但當(dāng)料液比比例過(guò)高后,sPPO酶溶解量不再增加,提取液被稀釋,會(huì)對(duì)比活力造成一定的影響[16]。由圖1B可知,浸提時(shí)間會(huì)顯著影響sPPO的比活力(P<0.05),當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到12 h,sPPO的比活力達(dá)到最大值,之后隨著浸提時(shí)間增加基本保持恒定。不同于李曉麗等[9]的報(bào)道,浸提時(shí)間的延長(zhǎng),酶蛋白在溶液中構(gòu)象不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致無(wú)核白葡萄中PPO活力降低,馬鈴薯PPO性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。由圖1C可知,緩沖液pH在7.0時(shí)sPPO比活力達(dá)到最大值,過(guò)高或過(guò)低的緩沖液pH均使sPPO比活力顯著降低(P<0.05)?？赡茉蛉缦?sPPO的輔基是銅離子,銅離子在酸性條件下會(huì)被解離出來(lái),從而使酶失去活性,而銅離子在堿性條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為氫氧化銅沉淀,脫離酶蛋白,使酶失去活性;反應(yīng)體系的pH影響底物,從而減弱催化反應(yīng)效率[17]。

圖1 料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、緩沖液pH(C)對(duì)sPPO比活力的影響

2.2 sPPO提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原則,選取料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、緩沖液pH(C)為自變量,以sPPO比活力為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)sPPO提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程與顯著性分析 將表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合,得回歸模型方程為:

Y=130.60+2.40A+3.06B+1.41C-1.68AB+1.68AC+0.60BC-3.03A2-5.60B2-11.30C2

模型的可靠性可以從方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析

由表4可知,模型F=288.74,所得sPPO提取條件的回歸方程極顯著(P<0.0001);F失擬=4.83,失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),從而該模型可以對(duì)sPPO提取工藝條件進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和分析。R2=99.73%,說(shuō)明sPPO比活力的變化有99.73%來(lái)源于料液比、浸提時(shí)間和緩沖液pH的影響。方差分析結(jié)果表明:一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素,其中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值均有極顯著性影響(P<0.01),三個(gè)因素對(duì)sPPO提取的影響大小依次為:浸提時(shí)間(B)>料液比(A)>緩沖液pH(C)。

2.2.3 響應(yīng)面分析 圖2表示料液比分別與浸提時(shí)間和緩沖液pH的交互作用對(duì)sPPO比活力的影響。由圖2可知,固定浸提時(shí)間,隨著料液比升高sPPO比活力均呈先升高后降低趨勢(shì);固定料液比,sPPO比活力均隨緩沖液pH的升高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化趨勢(shì)一致。由方差分析可知,不同因素交互作用對(duì)sPPO比活力影響顯著,與其相對(duì)應(yīng)的等高線(xiàn)形狀為橢圓形,表明料液比和浸提時(shí)間、料液比和緩沖溶液pH的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

圖2 料液比、浸提時(shí)間和緩沖液pH的交互作用

根據(jù)回歸模擬方程,得到最優(yōu)sPPO提取工藝條件為:料液比為1∶3.16,浸提時(shí)間12.31 h,緩沖液pH為7.07。在此條件下sPPO比活力的預(yù)測(cè)值為131.3 U/mg,考慮到實(shí)際操作的可行性,將最優(yōu)提取工藝修正為:料液比為1∶3.2,浸提時(shí)間12 h,緩沖液pH為7.1,在該條件下測(cè)定sPPO比活力平均值達(dá)(130.5±2.4) U/mg,與預(yù)測(cè)值基本一致。因此該模型可以很好的反映最優(yōu)的sPPO提取工藝條件。

2.3 mPPO提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3A可知,隨著料液比比例增加,mPPO的比活力顯著升高(P<0.05),當(dāng)料液比達(dá)到1∶5時(shí),mPPO比活力達(dá)到最大值,隨后mPPO比活力緩慢降低。由圖3B可知,當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到6 h,mPPO的比活力達(dá)到最大值,之后隨著浸提時(shí)間增加基本保持恒定。由圖3C可知,緩沖液pH在7.0時(shí)mPPO比活力達(dá)到最大值,過(guò)高或過(guò)低的緩沖液pH均使mPPO比活力顯著降低(P<0.05)。料液比、超聲時(shí)間和緩沖液pH對(duì)mPPO比活力的影響趨勢(shì)與sPPO相同,但是mPPO比活力顯著高于sPPO比活力,mPPO很容易被激活,且mPPO被激活后性質(zhì)比sPPO活躍,是導(dǎo)致馬鈴薯加工過(guò)程中褐變的主要影響因素[18]。

圖3 料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、緩沖液pH(C)對(duì)mPPO比活力的影響

2.4 mPPO提取的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原則,選取料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、緩沖液pH(C)為自變量,以mPPO比活力為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)mPPO提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 5 Experimental scheme and results of response surface optimization

2.4.2 回歸方程與顯著性分析 將表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合,得回歸模型方程為:

Y=684.56+7.71A+12.64B+2.90C+1.90AB-5.58AC-13.18BC-11.68A2-15.53B2-20.50C2

模型的可靠性可以從方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回歸模型方差分析

由表6可知,模型F=131.94,所得mPPO提取條件的回歸方程極顯著(P<0.0001);F失擬=2.10,失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),從而該模型可以對(duì)mPPO提取工藝條件進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和分析。R2=99.41%,說(shuō)明mPPO比活力的變化有99.41%來(lái)源于料液比、超聲時(shí)間和緩沖液pH的影響。方差分析結(jié)果表明:一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素,其中A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2均顯著,各因素對(duì)mPPO比活力具有交互影響的非線(xiàn)性關(guān)系,三個(gè)因素對(duì)mPPO提取的影響大小依次為:超聲時(shí)間(B)>料液比(A)>緩沖液pH(C)。

2.4.3 響應(yīng)面分析 圖4表示緩沖液pH分別與超聲時(shí)間和料液比對(duì)mPPO比活力的交互影響。由圖4可知,無(wú)論緩沖液pH處于何種水平,mPPO比活力隨著料液比升高均呈先升高后基本維持穩(wěn)定,隨超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后保持恒定的趨勢(shì),與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化趨勢(shì)一致。由方差分析可知,不同因素交互作用對(duì)mPPO比活力影響顯著,與其相對(duì)應(yīng)的等高線(xiàn)形狀為橢圓形,表明緩沖溶液pH和超聲時(shí)間、緩沖溶液pH和料液比交互作用顯著。

圖4 料液比、超聲時(shí)間和緩沖液pH的交互作用

根據(jù)回歸模擬方程,得到最優(yōu)mPPO提取工藝條件為:料液比為1∶5.20,超聲時(shí)間6.64 h,緩沖液pH為6.71。在此條件下mPPO比活力的預(yù)測(cè)值為687.7 U/mg,考慮到實(shí)際操作的可行性,將最優(yōu)提取工藝修正為:料液比為1∶5.2,浸提時(shí)間7 h,緩沖液pH為6.7,在該條件下測(cè)定mPPO比活力平均值達(dá)(686.4±7.9) U/mg,與預(yù)測(cè)值基本一致。因此該模型可以很好的反映最優(yōu)的mPPO提取工藝條件。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以大西洋馬鈴薯為原料,通過(guò)超聲波輔助-緩沖溶液浸提法提取馬鈴薯中sPPO和mPPO,并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取過(guò)程中料液比、提取時(shí)間、緩沖液pH等因素進(jìn)行優(yōu)化,以酶比活力為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定最優(yōu)的sPPO和mPPO提取工藝。優(yōu)化后的sPPO提取工藝為:料液比為1∶3.2,浸提時(shí)間12 h,緩沖液pH為7.1,在該條件下測(cè)定sPPO比活力平均值達(dá)(130.5±2.4) U/mg,三個(gè)因素對(duì)sPPO提取的影響大小依次為:浸提時(shí)間>料液比>緩沖液pH。優(yōu)化后的mPPO提取工藝為:料液比為1∶5.2,浸提時(shí)間7 h,緩沖液pH為6.7,在該條件下測(cè)定mPPO比活力平均值達(dá)(686.4±7.9) U/mg,三個(gè)因素對(duì)mPPO提取的影響大小依次為:超聲時(shí)間>料液比>緩沖液pH。通過(guò)實(shí)驗(yàn)所得響應(yīng)面模型可以對(duì)sPPO和mPPO提取工藝進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和分析。