基于網(wǎng)絡藥理學分析“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的潛在作用機制

程祺 郝珍珠 樸星虎 王冰梅

(長春中醫(yī)藥大學 1臨床醫(yī)學院，吉林 長春 130117；2臨床醫(yī)學院生理教研室)

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因，其中80%是非小細胞肺癌，好發(fā)于老年人〔1,2〕。2012年，超過160萬人死于肺癌，預計到2035年，這一數(shù)字將增至300萬，繼續(xù)成為主要的健康問題〔3,4〕。老年肺癌現(xiàn)階段治療主要采用手術、靶向藥物治療、化療及放療等〔5，6〕。近年來，針對免疫檢查點抑制劑(ICIs)開展的免疫治療研究日益增多，為老年肺癌的治療提供了新的思路〔7〕。而中國傳統(tǒng)醫(yī)藥在老年肺癌治療療效的提升、放化療毒副作用的減輕及生存質(zhì)量提高等多方面尤為關鍵。

“陳皮-半夏”是中醫(yī)臨床上常用的理氣化痰藥對，臨床治療上多與呼吸系統(tǒng)疾病相關。陳皮、半夏均性辛、溫，都歸脾、肺經(jīng)，兩者配伍，相互促進，散降有序，使脾氣運而痰自化。研究表明，痰證為肺癌晚期患者的主要證候，而且近年以“陳皮-半夏”為君臣藥對治療腫瘤的研究日益增多，尤其是肺癌〔8〕。藥理研究也表明以“陳皮-半夏”為君臣的二陳湯，可逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用，認為其作用主要與通過Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導通路而使多藥耐藥相關蛋白(MRP)1和P-糖蛋白(P-gp)表達下降有關〔9〕。但是，由于中草藥是通過調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)而不是單一靶點起作用，目前“陳皮-半夏”藥對治療肺癌上的研究還難以有效、科學、全面地闡釋其作用機制。

網(wǎng)絡藥理學是一種包括系統(tǒng)生物學、網(wǎng)絡分析、連接性、冗余性和多效性的藥物設計方法〔10〕，可以更科學、全面地用來評價中藥有效性的作用靶點、通路等。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理分析老年肺癌患者應用“陳皮-半夏”藥對治療的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1檢索藥對的有效成分及靶基因 從中草藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫平臺(TCMSP)〔11〕檢索得到“陳皮-半夏”藥對的成分和靶基因。根據(jù)藥物代謝動力學(ADME)〔12〕原理的口服藥物相似性(DL)≥0.18及生物利用度(OB)篩選成分，從而能夠獲得“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分。“陳皮-半夏”藥對的有效成分所對應的靶基因運用Perl語言進行獲取。

1.2檢索疾病的相關基因 GeneCards〔13〕基本覆蓋了幾大數(shù)據(jù)庫對于基因的分析數(shù)據(jù)，是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫。將“l(fā)ung cancer”作為關鍵詞進行檢索，獲得老年肺癌相關的基因。將“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分所對應的靶基因與老年肺癌相關基因進行映射，取兩數(shù)據(jù)集的交集，以此能夠獲得老年肺癌“陳皮-半夏”藥對治療的基因組合。

1.3構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡 Cytoscape是一款圖形化顯示網(wǎng)路并進行分析和編輯的軟件，它是研究中藥網(wǎng)絡藥理學常用的軟件。本研究使用Cytoscape(Version3.6.1)，導入“陳皮-半夏”藥對有效成分和老年肺癌的靶基因數(shù)據(jù)，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。其中，節(jié)點(node)代表“陳皮-半夏”藥對、老年肺癌、藥對的有效活性成分、關鍵靶基因等；邊“edge”代表“陳皮-半夏”藥對與其活性成分、靶基因與肺癌、靶基因與活性成分等相關性。該系統(tǒng)網(wǎng)絡分析進一步推斷了“陳皮-半夏”藥對作用于老年肺癌的藥理機制。

1.4構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡 String數(shù)據(jù)庫〔14〕主要是用于預測蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)間相互作用進行搜索的一個數(shù)據(jù)庫，而通過該數(shù)據(jù)庫能夠用于2 031個物種，其中包括1 380萬種蛋白質(zhì)與960萬種蛋白間相互作用，常用來構建PPI網(wǎng)絡。將“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因數(shù)據(jù)導入Srting數(shù)據(jù)庫，在“Home sapiens”范圍內(nèi)，構建PPI網(wǎng)絡。在構建網(wǎng)絡的過程中，可對蛋白間相互作用的置信度設定閾值，本研究選擇中等置信度0.4，對PPI進行篩選。

1.5基因本體(GO)及基因組百科全書(KEGG)富集分析 R是屬于GNU系統(tǒng)的一個自由、免費、源代碼開放的軟件，它是一個常用于生物信息分析和可視化的優(yōu)秀工具。在R軟件(Version3.6.2)中安裝Bioconductor相關軟件包，將數(shù)據(jù)轉化為基因名稱(entrezID)，定義P<0.05，Q<0.05來進行GO和KEGG的富集分析，且以氣泡圖與條形圖形式將結果給予輸出。

2 結 果

2.1“陳皮-半夏”活性成分及靶基因 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共獲取63種陳皮成分，獲取116種半夏成分。根據(jù)DL≥0.18與OB≥30%篩選成分，其中獲得5個陳皮，13個半夏的有效活性成分，“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分總共18種，見表1。選擇“Related Targeted”，檢索得陳皮相關靶基因479個，半夏相關靶基因1 302個，“陳皮-半夏”藥對相關靶基因共1 781個。用Perl語言獲取“陳皮-半夏”藥對有效活性成分所對應的靶基因共288個。

表1 “陳皮-半夏”藥對的有效活性成分及OB、DL

2.2老年肺癌的相關基因 按“l(fā)ung cancer”為關鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，檢索出21 901個肺癌相關基因，然后將其與“陳皮-半夏”藥對有效活性成分所對應的靶基因進行映射，得到“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因共56個。

2.3“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡 將“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分、成分作用的靶基因及老年肺癌相關靶基因的數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，以此構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。

2.4PPI網(wǎng)絡的構建 將“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因輸入String，選擇中等置信度0.4，構建PPI網(wǎng)絡。PPI網(wǎng)絡顯示了靶基因編碼蛋白之間的相互作用關系。使用R語言來提取蛋白間相互作用關系最緊密的核心基因，用橫向條形圖來表示。其中排在前5的基因是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A、雌性激素受體(ESR)1、原癌基因(FOS)、細胞凋亡因子終末剪切酶(CASP3)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK8)。

2.5GO富集分析 通過R語言實現(xiàn)“陳皮-半夏”藥對核心靶基因的GO功能富集分析，其涉及77種生物學過程，并且通過P值矯正排序，而其中選擇前20采用橫條形圖表示?！瓣惼?半夏”藥對主要參與轉錄因子活性、核受體功能、乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。

2.6KEGG富集分析 通過R語言實現(xiàn)“陳皮-半夏”藥對核心靶基因的KEGG功能富集分析，其治療老年肺癌涉及82條信號通路，矯正P值進行排序，選擇前20以橫條形圖表示。其涉及細胞凋亡、p53、白細胞介素(IL)-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路，同時也包括結直腸癌、前列腺癌等其他腫瘤相關信號通路。

3 討 論

老年肺癌的病機多傾向于肺臟功能失調(diào)，氣機不利，津液失于輸布，津液聚而為痰，痰凝氣滯。所以痰濕阻肺是其主要的病理機制之一?！夺t(yī)林繩墨》卷二也論述了這類病機產(chǎn)生的過程：“人之氣道，貴處清順，其痰不生。設若窒塞其間，痰必壅盛?；蛞蝻L、寒、署、濕、熱之外感，或因七情、飲食內(nèi)傷，以致氣逆液濁，而變?yōu)橹T癥之所生焉?！薄瓣惼?半夏”是中醫(yī)臨床上常用的理氣化痰藥對，因此“陳皮-半夏”藥治療痰證型肺癌機制值得深入研究。

在本研究中，“陳皮-半夏”藥對的主要活性成分為柚皮素、川陳皮素、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、松柏素等。已有研究表明，柚皮素是通過誘導人肺癌A549細胞的死亡受體(DR)5表達〔15〕，來抑制A549細胞的增殖并誘導其凋亡〔16〕。柚皮素能誘導NcI-H2170細胞產(chǎn)生G1期阻滯，使得多聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白表達量下降，從而抑制人肺鱗癌NcI-H2170細胞增殖。同時它還可以促使凋亡因子BH3結構域凋亡誘導蛋白(Bid)表達上調(diào)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)表達下調(diào)，半胱天冬酶-3酶原(Procaspase-3)、Procaspase-8被激活，誘導NcI-H2170細胞凋亡〔17〕。Qin等〔18〕發(fā)現(xiàn)小鼠口服柚皮素可明顯減少腫瘤細胞向肺轉移的數(shù)量。而川陳皮素具有預防各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，具有抑制多種腫瘤細胞增殖作用〔19〕。黃芩苷則可以通過阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖來達到直接抗腫瘤的作用，同時其抗氧化、抗炎作用可以直接影響腫瘤細胞的增殖〔20〕。從“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇作用于CASP9、CASP3、CASP8等與細胞凋亡密切相關的靶點，所以其可能對治療老年肺癌有效，值得進行深入的藥理學研究。

構建PPI網(wǎng)絡得到核心靶基因，其中VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、MAPK8處于核心的位置，與其余蛋白有著密切的聯(lián)系。VEGFR與腫瘤細胞的增殖、生長、遷移、分化和凋亡密切相關，進而影響肺癌的轉移和預后〔21〕。ESR2基因的多態(tài)性則與非吸煙女性肺癌的發(fā)病存在關聯(lián)〔22〕。c-FOS在非小細胞肺癌中的表達陽性率均明顯高于癌旁組織，且其表達與淋巴轉移有關〔23〕。CASP3與細胞凋亡密切相關，并且影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療療效〔24〕。

GO功能富集集中于轉錄因子活性、核受體功能、乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。KEGG功能富集集中于細胞凋亡、p53、IL-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路。p53是抑癌基因，可以通過上調(diào)p53及其下游基因的表達來促進肺癌細胞凋亡〔25〕。IL-17A/IL-17RA可通過激活非小細胞肺癌細胞中的p38 MAPK信號通路上調(diào)MMP-2、MMP-9表達，對非小細胞肺癌惡性生物學行為進行影響，而促進其進展〔26〕。所以“陳皮-半夏”藥對老年肺癌治療的作用機制可能與上述信號通路密切相關。

網(wǎng)絡藥理學是一種藥物設計方法，應用該方法能夠?qū)χ兴幓钚猿煞峙c靶基因相關性進行更加高效的獲取，但應用該方法無法確切獲得活性成分對靶基因的調(diào)控關系，仍需實驗加以驗證。

綜上所述，“陳皮-半夏”藥對和老年肺癌靶基因的主要活性成分為柚皮素、川陳皮素、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、松柏素等，其中β-谷甾醇現(xiàn)研究較少，值得進行深入的藥理學研究?！瓣惼?半夏”藥對對老年肺癌作用的機制可能與VEGFR、ESR2、FOS、CASP3、MAPK8表達的蛋白密切相關，可能與其調(diào)節(jié)細胞凋亡、p53、IL-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路相關。