細(xì)胞增殖上調(diào)因子促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制

馮濤 楊霄鵬 李富強(qiáng) 劉前 白銀雪

(1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473058；2鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種發(fā)病率和死亡率均較高的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制并不完全清晰，研究其發(fā)病的可能機(jī)制對(duì)防治神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有重要意義。細(xì)胞增殖上調(diào)因子(URGCP)又稱為上調(diào)基因(URG)4，可通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)基因的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等生理過(guò)程，與消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等腫瘤的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)〔1～3〕。然而，目前發(fā)現(xiàn)URGCP在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的研究較多，而在膠質(zhì)瘤的研究較少〔4，5〕。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)URGCP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，構(gòu)建URGCP沉默或過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株NHA購(gòu)于美國(guó)ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172、U251和U87購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，URGCP-siRNA和陰性對(duì)照序列Scrambled siRNA及pcDNA3.0-URGCP重組質(zhì)粒及pcDNA3.0空載體質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Ambion公司?？偟鞍滋崛≡噭┖泻椭|(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，二辛可寧酸蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce 公司。URGCP抗體(1∶1 000)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，胰蛋白酶、胎牛血清、MTT試劑和GAPDH抗體(1∶1 000)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，IκBα抗體(1∶500)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體(1∶500)、CyclinE1抗體(1：800)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB/p65抗體(1∶500)和羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶2 000)均購(gòu)于美國(guó)Santa cruz 公司，p-IκBα抗體(1∶1 000)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 以37℃水浴解凍復(fù)蘇儲(chǔ)存的NHA、A172、U251和U87細(xì)胞，采用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2 d換液培養(yǎng)，待細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3Western印跡檢測(cè) 收集生長(zhǎng)良好的NHA、A172、U251和U87細(xì)胞，以總蛋白提取試劑盒提取各種細(xì)胞的總蛋白，并采用二辛可寧酸蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。取適量蛋白加入等體積上樣緩沖液，置于沸水浴中變性5～10 min。取變性蛋白60 μg行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。蛋白分離結(jié)束后，采用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。將帶有蛋白樣品的聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入封閉液(含50 g/L去脂奶粉)封閉處理1～2 h。封閉液洗膜后，加入特異性一抗4℃下孵育24 h。再以封閉液洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗于37℃下反應(yīng)1 h。以二氨基聯(lián)苯胺顯影后，以GAPDH作內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析目的蛋白的灰度值。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)CyclinD1和CyclinE1蛋白及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)亦采用上述方法。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將長(zhǎng)勢(shì)良好的U87細(xì)胞和A172細(xì)胞以每孔106個(gè)接種至6孔板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)將URGCP-siRNA和Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，分別標(biāo)記為siURGCP組、Scrambled組，并以只加入脂質(zhì)體2000的U87細(xì)胞作為空白1組。同樣方法將pcDNA3.0-URGCP和pcDNA3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A172細(xì)胞中，并標(biāo)記為URGCP組、Vector組，同時(shí)設(shè)置只加入轉(zhuǎn)染試劑的A172細(xì)胞為空白2組。兩種細(xì)胞均在轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，再于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后，收集各組細(xì)胞，采用Western印跡檢測(cè)URGCP的表達(dá)情況。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以每孔104個(gè)細(xì)胞種植到96孔板上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。設(shè)置24、48、72和96 h 4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，分別培養(yǎng)至所需時(shí)間點(diǎn)后，取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μl、5 g/L MTT溶液，常溫下反應(yīng)4 h后，加入150 μl二甲基亞砜震蕩反應(yīng)10 min，以酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處的吸光(OD)值，將對(duì)照組細(xì)胞的活力設(shè)為1，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。根據(jù)細(xì)胞活力繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以每孔2 ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為600個(gè)/ml)接種至6孔細(xì)胞板上。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)10 d。采用磷酸緩沖液洗滌后，每孔加1 ml 4%多聚甲醛固定10 min。再加入1 ml結(jié)晶紫染色10 min。洗滌晾干后，顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)即大于50個(gè)細(xì)胞的集落個(gè)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1URGCP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá) URGCP蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤A172、U251和U87細(xì)胞中的表達(dá)水平(0.34±0.03、1.02±0.1、1.23±0.12)依次增大，且均明顯大于正常星形膠質(zhì)NHA細(xì)胞(0.15±0.02，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 URGCP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2構(gòu)建沉默URGCP的U87細(xì)胞和過(guò)表達(dá)URGCP的A172細(xì)胞 轉(zhuǎn)染URGCP-siRNA后，U87細(xì)胞中URGCP蛋白表達(dá)水平(0.22±0.02)較空白1組(0.83±0.08)明顯降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染Scrambled siRNA后，U87細(xì)胞中URGCP蛋白表達(dá)水平(0.79±0.08)與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-URGCP的A172細(xì)胞中URGCP蛋白表達(dá)(0.76±0.08)較空白2組(0.35±0.04)明顯升高(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒的A172細(xì)胞中URGCP蛋白表達(dá)(0.34±0.03)與空白2組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 URGCP在U87細(xì)胞和A172細(xì)胞中的表達(dá)

2.3沉默URGCP抑制U87細(xì)胞增殖 MTT檢測(cè)0、24、48、72和96 h作用時(shí)間下空白1組細(xì)胞的相對(duì)活力分別為0.20±0.02、0.42±0.05、0.65±0.07、0.89±0.09、1.21±0.13，Scrambled組分別為0.22±0.02、0.38±0.04、0.60±0.07、0.85±0.09、1.14±0.13，siURGCP組為0.21±0.02、0.32±0.03、0.39±0.04、0.44±0.04、0.47±0.05。比較24、48、72和96 h同一作用時(shí)間發(fā)現(xiàn)，siURGCP組細(xì)胞的相對(duì)活力較空白1組明顯降低(P<0.05)，而Scrambled組與空白1組相比未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。同時(shí)，克隆形成實(shí)驗(yàn)得到，siURGCP組細(xì)胞的克隆數(shù)明顯低于空白1組(39.24±2.14 vs 113.54±6.58，P<0.05)，而Scrambled組(109.13±5.32)與空白1組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4過(guò)表達(dá)URGCP促進(jìn)A172細(xì)胞增殖 MTT檢測(cè)各組A172細(xì)胞的相對(duì)活力發(fā)現(xiàn)，0、24、48、72和96 h作用時(shí)間下，空白2組細(xì)胞的相對(duì)活力分別為 0.21±0.02、0.27±0.03、0.35±0.04、0.46±0.05、0.55±0.06，Vector組分別為0.21±0.02、0.24±0.03、0.32±0.03、0.42±0.04、0.51±0.05，URGCP組分別為0.22±0.02、0.38±0.04、0.54±0.05、0.79±0.08、1.04±0.11。同一作用時(shí)間下(24、48、72和96 h)比較發(fā)現(xiàn)，在A172細(xì)胞中過(guò)表達(dá)URGCP后，與沉默URGCP抑制U87細(xì)胞增殖的結(jié)果相反，URGCP組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)；同時(shí)，URGCP組細(xì)胞的克隆數(shù)明顯大于空白2組(129.60±12.54 vs 67.24±5.32，P<0.05)。與空白2組相比，Vector組細(xì)胞活力及克隆數(shù)(64.57±6.18)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組U87、A172細(xì)胞的克隆情況

2.5沉默URGCP抑制U87細(xì)胞中CyclinD1和CyclinE1表達(dá) 空白1組與Scrambled組CyclinD1、 CyclinE1蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.97±0.10 vs 1.01±0.11，1.25±0.13 vs 1.31±0.13，P>0.05)，但siURGCP組(0.32±0.03、0.15±0.02)較空白1組均明顯降低(P<0.05)。在A172細(xì)胞中，與空白2組相比，Vector組細(xì)胞中CyclinD1、 CyclinE1蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.25±0.03 vs 0.32±0.03，0.15±0.02 vs 0.12±0.01，P>0.05)，而URGCP組(0.62±0.05、0.78±0.08)顯著高于空白2組。見(jiàn)圖4。

圖4 URGCP對(duì)CyclinD1和CyclinE1蛋白表達(dá)的影響

2.6沉默URGCP抑制U87細(xì)胞中NF-κB通路 在U87細(xì)胞中，空白1組、Scrambled組和siURGCP組中p-IκBα蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.35±0.14、1.28±0.13、0.22±0.02；IκBα分別為0.97±0.11、0.92±0.09、1.01±0.10；細(xì)胞質(zhì)中NF-κB/p65表達(dá)水平分別為0.32±0.03、0.37±0.04、0.81±0.08，而細(xì)胞核中NF-κB/p65表達(dá)水平分別0.87±0.09、0.91±0.09、0.33±0.03。可見(jiàn)，沉默URGCP表達(dá)使U87細(xì)胞中 p-IκBα和胞核NF-κB/p65表達(dá)降低(P<0.05)，而使胞質(zhì)NF-κB/p65表達(dá)升高(P<0.05)。在A172細(xì)胞中?？瞻?組、Vector組和URGCP組細(xì)胞中p-IκBα蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別0.12±0.01、0.15±0.02、0.57±0.06，IκBα分別為0.31±0.03、0.28±0.03、0.32±0.03，胞質(zhì)NF-κB/p65分別為0.55±0.05、0.53±0.05、0.29±0.03，胞核NF-κB/p65分別為0.52±0.05、0.61±0.06、1.06±0.11。見(jiàn)圖5。

圖5 URGCP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討 論

URGCP是一種定位于7q13染色體可編碼922個(gè)氨基酸的腫瘤相關(guān)基因，在多種腫瘤細(xì)胞或組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良關(guān)系密切〔6,7〕。URGCP已被證實(shí)在鼻咽癌和宮頸癌組織或細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與臨床分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，URGCP高表達(dá)的患者預(yù)后較差〔8,9〕。URGCP作為一種促癌基因，在腫瘤的多種生物學(xué)功能如血管生成、化療藥物耐藥、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔10〕。在肝癌中，URGCP可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的血管生成〔11〕；URGCP過(guò)表達(dá)增加了順鉑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的能力，并促進(jìn)了抗凋亡基因Bcl-2、生存素(survivin)、髓樣細(xì)胞白血病(MCL)-1和LIP的表達(dá)〔12〕；抑制URG4的表達(dá)可通過(guò)下調(diào)CyclinD1、β-catenin 及c-myc的表達(dá)抑制宮頸癌小鼠的生長(zhǎng)〔13〕；URGCP通過(guò)NF-κB活化增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9表達(dá)促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞的侵襲、遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而下調(diào)URGCP則抑制了這些惡性特征〔14〕。可見(jiàn)，URGCP基因與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，干擾其表達(dá)有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。然而，目前URGCP與膠質(zhì)瘤的研究較少，其對(duì)膠質(zhì)瘤的調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步觀察URGCPP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。本研究結(jié)果提示，URGCP可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。CyclinD1和CyclinE1均是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期時(shí)發(fā)揮重要的促進(jìn)作用；同時(shí)CyclinD1也是導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控的原癌基因，兩者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用〔15,16〕。NF-κB信號(hào)通路是一種與多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤發(fā)展密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路〔17,18〕。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)IκBα可被磷酸化，從NF-κB/p65與IκBα形成的復(fù)合物中降解，從而激活NF-κB/p65進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因如CyclinD1和CyclinE1等參與調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程〔19,20〕。已有研究〔11，21〕證實(shí)下調(diào)URGCP可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CyclinD1、CyclinE1、IκBα、p-IκBα和胞核內(nèi)外NF-κB/p65蛋白的表達(dá)，以評(píng)價(jià)URGCP促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性增殖的分子機(jī)制，研究結(jié)果提示，URGCP可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性增殖。

綜上，URGCP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。本研究?jī)H從體外細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)了URGCP對(duì)膠質(zhì)瘤的促增殖作用，后續(xù)有待從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。