不同濃度七氟烷麻醉后對(duì)大鼠α4乙酰膽堿受體及認(rèn)知功能的影響

曾暉 陳桂萍 林小龍 丘祿英 謝在斌 肖海榮

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍巖人民醫(yī)院，福建 龍巖 364000)

七氟烷是一種優(yōu)良的全身麻醉劑，無(wú)色無(wú)刺激，與其他常規(guī)全身麻醉劑相對(duì)比，具有不可燃、誘導(dǎo)期短、蘇醒快、容易控制麻醉深度的特點(diǎn)，且毒副作用更小，已經(jīng)作為新型的吸入型麻醉劑廣泛運(yùn)用于臨床〔1〕。全身麻醉術(shù)后患者易發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)，表現(xiàn)為記憶力、學(xué)習(xí)力、集中力的損害，嚴(yán)重者可引發(fā)癡呆，其發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為與神經(jīng)遞質(zhì)的改變相關(guān)，中樞神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的異常可導(dǎo)致認(rèn)知功能的異常。有研究顯示，不同年齡大鼠吸入七氟烷均可引起認(rèn)知功能損害〔2，3〕，具體機(jī)制尚未闡明，本研究擬從中樞神經(jīng)遞質(zhì)受體α4乙酰膽堿受體(α4-nAchR)的變化情況入手，探討七氟烷對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑與儀器 4月齡SD成年大鼠120只，雌雄各半，體重300 g左右(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司)，Morris水迷宮試驗(yàn)(成都泰盟科技有限公司提供)，自動(dòng)曝光儀(美國(guó)Bio-Rad)，時(shí)實(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)

1.2實(shí)驗(yàn)方法 120只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(con)組、1%七氟烷(S1)組、2%七氟烷(S2)組、3%七氟烷(S3)組，麻醉前均進(jìn)行5 d的Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練，水迷宮為一圓形水池，分為四個(gè)象限，每個(gè)象限中點(diǎn)標(biāo)記為大鼠入水點(diǎn)，第四象限上設(shè)置黑色平臺(tái)，將平臺(tái)置于水面下1 cm，每天訓(xùn)練4次，將大鼠分別從四個(gè)象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，限定大鼠2 min內(nèi)找到平臺(tái)并在平臺(tái)上休息10 s，若未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，則用木棒指引其找到平臺(tái)并休息10 s，記錄4次逃避潛伏期及總路程計(jì)算平均值。訓(xùn)練結(jié)束后開(kāi)始麻醉，將大鼠放入80 cm×50 cm×20 cm的自制密閉透明容器中，容器有兩個(gè)開(kāi)口，一個(gè)連接麻醉機(jī)，另一個(gè)連接濃度監(jiān)測(cè)儀，保持容器內(nèi)麻醉藥物在指定的濃度不變。對(duì)照組吸入空氣，S1、S2、S3組分別吸入1%、2%、3%七氟烷，吸入時(shí)間均為2 h，麻醉結(jié)束后每組均分為三個(gè)亞組，即刻蘇醒組(麻醉后2 h)、麻醉后24 h組及麻醉后72 h組，每個(gè)亞組各10只。

1.3觀察指標(biāo) (1)認(rèn)知力測(cè)試：在麻醉后各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行記憶力及認(rèn)知功能測(cè)試，利用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行定位航海測(cè)試及空間探索測(cè)試：撤去平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)象限的右側(cè)象限入水，游泳2 min，記錄原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比、原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比和原平臺(tái)象限進(jìn)入次數(shù)百分比。(2)大鼠海馬體中α4-nAchR含量：在麻醉后各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)用Western印跡法檢測(cè)大鼠海馬體α4-nAchR蛋白量：取大鼠一側(cè)海馬組織，勻漿、裂解、研磨，離心，取上清液，測(cè)定蛋白濃度，電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入α4-nAchR單克隆抗體過(guò)夜后加入二抗，洗滌后于自動(dòng)曝光儀中曝光，與內(nèi)參 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量；在麻醉后各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬體α4-nAchR mRNA表達(dá)量：取大鼠一側(cè)海馬組織勻漿，加入1 ml Trizol 裂解，提取總RNA提取，根據(jù)沉淀物量加入無(wú)RNA酶水溶解 RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，配制反應(yīng)體系，加入相應(yīng)引物，分析結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1麻醉前大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期與總路程 隨著訓(xùn)練時(shí)間的推移，麻醉前大鼠逃避潛伏期與總路程逐漸縮短，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1、表2。

表1 麻醉前各組訓(xùn)練不同時(shí)間逃避潛伏期比較

表2 麻醉前各組訓(xùn)練不同時(shí)間總路程比較

2.2麻醉后各組逃避潛伏期與總路程 麻醉后S3組2 h、24 h、72 h及S1組2 h、24 h逃避潛伏期與總路程與對(duì)照組相比均顯著延長(zhǎng)；S2組2 h、24 h、72 h逃避潛伏期，2 h、24 h總路程與對(duì)照組相比均顯著延長(zhǎng)，除72 h逃避潛伏期外，S3組較S1、S2組延長(zhǎng)更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 麻醉后各組逃避潛伏期與總路程

2.3麻醉后各組空間探索能力對(duì)比 麻醉后S1組和S2組2 h、24 h，S3組2 h、24 h、72 h平臺(tái)象限滯留時(shí)間、平臺(tái)運(yùn)動(dòng)距離與對(duì)照組相比均顯著縮短，S3組較S1組縮短更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 麻醉后各組空間探索能力對(duì)比

2.4麻醉后各時(shí)間節(jié)點(diǎn)海馬體α4-nAchR mRNA表達(dá)情況 麻醉后各時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠海馬體α4-nAchR蛋白與對(duì)照組相比均顯著下降，S3組較S1組下降更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表5、表6、圖1。

表5 麻醉后各時(shí)間點(diǎn)海馬體α4-nAchRmRNA表達(dá)

表6 麻醉后各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬體α4-nAchR的蛋白表達(dá)

1：24-nAchR;2:β-actin圖1 麻醉后各時(shí)間點(diǎn)海馬體α4-nAchR蛋白表達(dá)

3 討 論

認(rèn)知功能是指大腦對(duì)外界信息進(jìn)行加工處理并反饋的功能，包含了記憶、學(xué)習(xí)、表達(dá)等方面的內(nèi)容，一旦出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，患者可出現(xiàn)記憶能力、學(xué)習(xí)能力、語(yǔ)言表達(dá)能力、理解能力的下降或減退。諸多因素均可影響認(rèn)知功能，手術(shù)全麻引起的認(rèn)知功能障礙在臨床上較為常見(jiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道新型吸入麻醉劑七氟烷雖具有誘導(dǎo)期短、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn)，但可引起蘇醒后學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能障礙〔4〕，常發(fā)生于術(shù)后3 d以?xún)?nèi)〔5〕，但發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，電生理學(xué)研究顯示，七氟烷可改變神經(jīng)元功能〔6〕，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，抑制新的神經(jīng)元的產(chǎn)生〔7〕，促進(jìn)淀粉樣蛋白聚集，也可抑制乙酰膽堿受體電流〔8〕，4%的七氟烷引起的認(rèn)知功能損傷可持續(xù)一個(gè)月之久。

海馬體是大腦中有關(guān)于學(xué)習(xí)和記憶功能的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中樞，可作為研究大腦學(xué)習(xí)和記憶力的理想模型〔9〕。海馬組織中的乙酰膽堿是目前發(fā)現(xiàn)的與學(xué)習(xí)、記憶功功能關(guān)系最為密切的神經(jīng)遞質(zhì)，有研究認(rèn)為麻醉引起的認(rèn)知功能障礙與煙堿型乙酰膽堿能受體的抑制相關(guān)。乙酰膽堿(Ach)是該主要通過(guò)毒蕈堿型(M)或煙堿型(N)受體發(fā)揮效應(yīng)。N型乙酰膽堿能受體是由乙酰膽堿激活的陽(yáng)離子選擇性通道的配體門(mén)控通道受體，至今已確認(rèn)有16種亞型，不同的亞型表現(xiàn)出不同的生理學(xué)特征。α4受體亞型是其中分布最多的受體亞型之一，廣泛存在于海馬體錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元，當(dāng)其受到抑制時(shí)，可出現(xiàn)遺忘癥狀。七氟烷引起的認(rèn)知功能障礙可能與α4nAchR表達(dá)下降相關(guān)，Solt等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥可以抑制α4神經(jīng)型，使人產(chǎn)生遺忘作用而發(fā)生認(rèn)知功能障礙，但這種抑制是可逆的，隨著時(shí)間的推移，患者認(rèn)知功能可逐漸恢復(fù)。Flood等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)吸入低濃度的異氟烷可以抑制 α4 nAchR 的表達(dá)，羅思琴等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，吸入3%濃度的七氟烷可使大鼠海馬體α7 nAchR 受體表達(dá)下降，引起認(rèn)知功能障礙，也有研究認(rèn)為七氟烷對(duì)成年及老年大鼠認(rèn)知功能無(wú)影響〔13〕，目前有關(guān)于七氟烷對(duì)大鼠海馬體中α4 nAchR 表達(dá)的影響鮮有報(bào)道，本研究從α4 nAchR 入手，探討了七氟烷對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制。

在臨床上，運(yùn)用七氟烷的有效劑量為1.2～1.5 MAC，換算到大鼠，1 MAC約為2.4%濃度〔14〕，為了觀察七氟烷對(duì)于大鼠認(rèn)知功能的影響與吸入濃度的關(guān)系，本研究設(shè)置了1%、2%、3% 3個(gè)濃度組，對(duì)于大鼠認(rèn)知功能的測(cè)定，選用了經(jīng)典的Morris水迷宮測(cè)試，水迷宮測(cè)試包括了定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，前者主要檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶力，后者則用來(lái)檢測(cè)記憶提取能力，目前廣泛運(yùn)用于評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的認(rèn)知功能〔15〕。本研究結(jié)果顯示吸入七氟烷后，大鼠學(xué)習(xí)記憶及提取能力均下降，且吸入濃度越高，影響越明顯，但隨著蘇醒時(shí)間的延長(zhǎng)，認(rèn)知功能逐漸趨向恢復(fù)，提示七氟烷對(duì)大鼠認(rèn)知功能影響是可恢復(fù)的。對(duì)海馬體中α4 nAchR的研究發(fā)現(xiàn)，麻醉后各組大鼠α4 nAchR蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均下降，吸入濃度越高，下降越明顯。

綜上所述，吸入七氟烷麻醉后可影響成年大鼠的認(rèn)知功能，吸入濃度越高，認(rèn)知功能障礙越明顯，這種影響可能與大鼠吸入麻醉后海馬體中α4 nAchR的表達(dá)下降相關(guān)。在將來(lái)的研究中，將進(jìn)一步探討相同濃度下吸入七氟烷不同時(shí)間后對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，并將從更多的神經(jīng)遞質(zhì)及受體方面進(jìn)行研究，深入探討七氟烷對(duì)認(rèn)知功能影響的作用機(jī)制。