Musashi-1下調(diào)在抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型中的意義

毛中臣 孫永 趙燕 陳卡佳 付志新 (開(kāi)封市中心醫(yī)院神內(nèi)重癥，河南 開(kāi)封 475000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)瘤)是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的50%，手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療等是目前膠質(zhì)瘤治療的主要途徑，隨著膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，尋找有效的靶基因治療膠質(zhì)瘤是研究的重點(diǎn)〔1〕。Musashi-1參與細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程，其是一個(gè)進(jìn)化極為保守的RNA結(jié)合蛋白。研究顯示Musashi-1可能是一種致癌基因，能夠刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加腫瘤細(xì)胞致瘤能力〔2〕。對(duì)結(jié)腸癌和肺腺癌的體外研究顯示，Musashi-1下調(diào)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔3～5〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建下調(diào)Musashi-1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，探討其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、侵襲等中的作用，為靶向Musashi-1治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87為賽業(yè)(蘇州)生物公司產(chǎn)品。細(xì)胞于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

兔抗活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、兔抗波形蛋白(vimentin)抗體為美國(guó)R&D Systems公司產(chǎn)品；兔抗MMP-2抗體、兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；Musashi-1 siRNA慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒載體由深圳中洪博元生物公司構(gòu)建；Musashi-1為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；Realtime PCR試劑為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品；Line Gene 9600 Plus熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)為杭州博日科技公司產(chǎn)品；Thermo Multiskan FC 酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo產(chǎn)品；Biosciences FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1慢病毒感染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期以后，分別種植到6孔板中，細(xì)胞接種密度為5×105個(gè)/孔，細(xì)胞密度為40%時(shí)，進(jìn)行感染。病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)=20，向細(xì)胞中加入病毒液(病毒液滴度為1×108tu/ml)，同時(shí)在細(xì)胞中添加聚凝胺(polyberne)，polyberne終濃度為5 μg/ml。培養(yǎng)8 h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，把原來(lái)的培養(yǎng)液吸棄，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用1 μg/ml的嘌呤霉素篩選，篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞株用Realtime PCR和Western印跡檢測(cè)干擾效果。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 把感染Musashi-1 siRNA慢病毒后的細(xì)胞記為si-Musashi-1組，把感染陰性對(duì)照慢病毒后的細(xì)胞記為si-NC組。把沒(méi)有感染的細(xì)胞記為Control組。

1.2.3Realtime PCR測(cè)定干擾效果 Control組、si-NC組、si-Musashi-1組細(xì)胞中添加Trizol(每個(gè)25 mm2的培養(yǎng)瓶中加入1 ml的Trizol)，將細(xì)胞置于冰上混合裂解以后，在裂解液中添加200 μl三氯甲烷溶液，并置于室溫條件孵育3 min，在4℃，10 000 r/min離心10 min后，吸取上層溶液約500 μl(RNA存在上層水相中)。添加等體積的異丙醇后，放在4℃條件下結(jié)合孵育30 min。離心后，添加75%乙醇將沉淀的RNA洗滌后，在室溫中干燥，添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，保存至-70℃。按照逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒合成cDNA，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s，4℃ 10 min。再進(jìn)行Realtime PCR，PCR的程序?yàn)椋?5℃ 15 s；58℃ 60 s，一共40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因Musashi-1的mRNA表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參。引物由南京金斯瑞合成。Musashi-1的上游引物序列為5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′，下游引物序列為5′-GTAATACGGT TATCCACGCG-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.2.4Western印跡測(cè)定干擾效果 向Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞中添加裂解液，并放置在冰上反應(yīng)20 min，4℃，10 000 r/min高速離心。蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液中混合后，煮沸5 min。按照每個(gè)泳道加入40 μg蛋白樣品，濃縮膠中80 V電壓，分離膠中100 V電壓進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜置于4℃中進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜電流設(shè)置為200 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)為2 h。取出轉(zhuǎn)膜后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于封閉液(5%脫脂奶)中室溫孵育2 h，用TBST洗滌后，再將PVDF膜放在1∶200稀釋的抗Musashi-1抗體中室溫孵育2 h。PVDF膜經(jīng)TBST洗滌后，置于1∶5 000稀釋的Ⅱ抗中室溫結(jié)合2 h。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色以后，以軟件Image J分析灰度值，以每組的β-actin灰度值為內(nèi)參，分析并計(jì)算Musashi-1/β-actin灰度值的比值，以此比值作為Musashi-1的蛋白表達(dá)水平。

1.2.5噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞活力 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，制成濃度為4×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸浮液，每個(gè)孔中加入100 μl種植到96孔板內(nèi)，把培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在24 h、48 h、72 h、96 h取出培養(yǎng)板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，添加10 μl的MTT溶液(濃度為5 mg/ml)顯色以后，加入二甲基亞砜(DMSO)孵育10 min。置于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀上檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A值)，以空白孔調(diào)零 。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞懸浮，制成濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。吸取1 ml的細(xì)胞懸浮液至5 ml的培養(yǎng)管內(nèi)，加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)染液，在避光條件下孵育15 min。添加400 μl的結(jié)合緩沖液混合以后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，制成濃度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，種植到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為80%時(shí)，在細(xì)胞中劃出一條劃痕，繼續(xù)置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定0 h和24 h時(shí)劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率變化。細(xì)胞遷移率=100%×(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.2.8Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 基質(zhì)膠濕化transwell小室2 h。Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液懸浮以后，在上室中添加200 μl的細(xì)胞懸浮液(約含有105個(gè)細(xì)胞)，在下室內(nèi)加入600 μl的含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。24 h后取出transwell小室，用棉簽將小室內(nèi)沒(méi)有穿膜的細(xì)胞擦掉，4%多聚甲醛固定后，用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下選取至少5個(gè)視野觀察細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.2.9Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、vimentin蛋白水平 取Control、si-NC、si-Musashi-1各組細(xì)胞，用Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3(抗體以1∶100稀釋)、MMP-2(抗體以1∶400稀釋)、MMP-9(抗體以1∶400稀釋)、E-cadherin(抗體以1∶600稀釋)、vimentin(抗體以1∶600稀釋)蛋白水平，步驟同1.2.4。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Musashi-1 siRNA慢病毒下調(diào)膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞中Musashi-1的表達(dá) 膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞感染Musashi-1 siRNA慢病毒后，細(xì)胞中的Musashi-1蛋白和mRNA水平均降低，說(shuō)明成功構(gòu)建了下調(diào)Musashi-1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。見(jiàn)表1、圖1、圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)U251細(xì)胞Musashi-1蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)U87細(xì)胞Musashi-1蛋白表達(dá)

表1 下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Musashi-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.2下調(diào)Musashi-1降低膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞活力 下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞A值明顯降低，說(shuō)明下調(diào)Musashi-1降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力。見(jiàn)表2。

表2 敲減Musashi-1表達(dá)后膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞A值的比較

2.3敲減Musashi-1表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞凋亡 敲減Musashi-1表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明下調(diào)Musashi-1可在體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表3、圖3～5。

表3 下調(diào)Musashi-1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3水平比較

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖4 Western印跡檢測(cè)U251細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)U87細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.4下調(diào)Musashi-1抑制膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞侵襲和遷移 下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲數(shù)目及遷移率均顯著降低，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著減少(P<0.05)，說(shuō)明下調(diào)Musashi-1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力。見(jiàn)表4、圖6、圖7。

表4 下調(diào)Musashi-1后膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平比較

圖6 Western印跡檢測(cè)U251細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

圖7 Western印跡檢測(cè)U87細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白

2.5下調(diào)Musashi-1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞中vimentin表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明下調(diào)Musashi-1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT。見(jiàn)圖8、圖9、表5。

圖8 Western印跡檢測(cè)U251細(xì)胞E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)

圖9 Western印跡檢測(cè)U87細(xì)胞E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)

表5 下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與RNA結(jié)合蛋白有關(guān)，在人類(lèi)的體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有800多種的RNA結(jié)合蛋白，在這些RNA結(jié)合蛋白中有的與轉(zhuǎn)錄因子功能相似，參與癌變過(guò)程，在腫瘤發(fā)生中具有促進(jìn)或者抑制作用〔6〕。Musashi-1屬于RNA結(jié)合蛋白，具有維持自我更新和分化等的作用，是多種細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物，是結(jié)腸癌等多種癌癥發(fā)生的調(diào)節(jié)劑〔7〕。人類(lèi)的Musashi-1基因含有兩個(gè)RNA結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中含有α-螺旋和β折疊，能夠與目的RNA結(jié)合，參與基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程〔8〕。很多研究顯示，Musashi-1在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，例如肝細(xì)胞肝癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等，沉默其表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌、肝癌等癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮促進(jìn)作用〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)Musashi-1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力降低，說(shuō)明Musashi-1在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮癌基因的作用。

腫瘤細(xì)胞凋亡減少腫瘤發(fā)生的重要原因之一，其受到細(xì)胞內(nèi)Caspase蛋白家族成員的調(diào)控，Caspase蛋白家族也是目前為止研究最為透徹的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，其蛋白成員活化后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔12〕。Caspase蛋白家族包括10個(gè)以上的蛋白成員，這些蛋白成員在活化之前沒(méi)有促凋亡作用，只有受到凋亡信號(hào)刺激以后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3是凋亡發(fā)生的下游執(zhí)行子，其活化水平升高后是不可逆細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志〔13〕。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，下調(diào)Musashi-1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡水平升高，細(xì)胞中Caspase-3活化水平升高，提示下調(diào)Musashi-1具有激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用。

EMT是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的早期標(biāo)志，EMT發(fā)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與相鄰細(xì)胞分開(kāi)，其上皮標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)水平下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin等表達(dá)水平升高〔14〕。MMP-2和MMP-9均屬于MMPs成員，二者在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用〔15〕。在肝癌中的研究顯示，過(guò)表達(dá)Musashi-1后的腫瘤細(xì)胞侵襲能力增加，下調(diào)Musashi-1可以下調(diào)癌細(xì)胞的遷移能力〔16〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)Musashi-1后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h的遷移、侵襲能力降低，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平下降，同時(shí)細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物vimentin表達(dá)水平降低，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平升高，提示下調(diào)Musashi-1可能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT和侵襲遷移能力。

Musashi-1在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)其表達(dá)后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87活力、侵襲、遷移能力降低，細(xì)胞凋亡增多，而對(duì)于其具體的作用機(jī)制尚未研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了Musashi-1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、侵襲等生物學(xué)特性發(fā)揮中的作用，這對(duì)于研究Musashi-1在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用機(jī)制具有重要意義，為靶向基因治療膠質(zhì)瘤提供了新思路。