老年尖銳濕疣患者光動力治療前后外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子測定

宣曉梅 董偉蘭 王貝貝 石麗平 陳立榮 林琳 張國強(qiáng)

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050031)

尖銳濕疣(CA)是人乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的復(fù)發(fā)率較高的性傳播疾病，近年來老年CA患者逐漸增多，其皮疹重、發(fā)病時間長，治療依從性差，嚴(yán)重影響其心理健康及生活質(zhì)量。研究表明CA發(fā)病、復(fù)發(fā)與機(jī)體的免疫尤其是細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)〔1,2〕，特別是淋巴細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子。目前CA常見治療方法包括外用藥、二氧化碳激光、光動力(ALA-PDT)治療等〔3〕，其中ALA-PDT治療除了直接去除疣體外還可以有效清除乳頭瘤病毒亞臨床感染和潛伏病灶，降低尖銳濕疣的復(fù)發(fā)，尤其適用于耐受性較差的老年CA患者。本文主要探討老年CA患者外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子情況及ALA-PDT治療后各指標(biāo)變化。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2016年1月至 2019年3月來河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科門診就診的老年CA患者117例，其中男69例、女48例，年齡60～71歲，平均(64.7±2.3)歲，病程1.5～6.2個月，平均(3.43±2.05)個月。初發(fā)組82例，其中男53例、女29例，年齡60～68歲，平均(63.1±10.5)歲，病程1.0～5.9個月，平均(2.65±1.31)個月；復(fù)發(fā)組35例，其中男16例、女19例，年齡63～71歲，平均(65.7±3.8)歲，病程3.0～7.4個月，平均(4.17±1.56)個月。入選病例均符合CA診斷標(biāo)準(zhǔn)并做病理證實(shí)。男性皮疹多見于陰莖、肛周；女性皮疹多見于會陰聯(lián)合及陰唇內(nèi)側(cè)。皮疹數(shù)量數(shù)個至數(shù)十個，大小為粟粒至指甲蓋大小不等。排除標(biāo)準(zhǔn)：有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、合并其他性病或者感染性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、近半年內(nèi)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑或者免疫調(diào)節(jié)劑者、光過敏者。另外選取醫(yī)院體檢中心同年齡段健康體檢者30例作為健康對照組。受試者均按要求簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器 熒光標(biāo)記單克隆抗體和溶血素均為美國BD公司產(chǎn)品；細(xì)胞因子試劑為杭州賽基生物科技有限公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀FACSCalibur為美國BD公司生產(chǎn)；5-氨基酮戊酸(ALA)為上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；XD-635AB型光動力激光治療儀由上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司技術(shù)開發(fā)監(jiān)制，桂林市興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，輸出波長為635 nm±3 nm，終端輸出光功率0～300 mW，連續(xù)可調(diào)。光纖耦合輸出，輸出模式為連續(xù)輸出。

1.3方法

1.3.1血液標(biāo)本采集 老年CA患者于治療前及3次ALA-PDT治療后抽取空腹靜脈血10 ml；健康對照組于入組時抽取空腹靜脈血10 ml。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群比值 取流式管并用移液器在其底部分別加入：CD4-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體20 μl、CD8-藻紅蛋白(PE)抗體20 μl、CD3-別藻青蛋白(APC)抗體10 μl、CD45-多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)抗體10 μl，然后加入100 μl全血，震蕩混勻10 s，避光靜置15 min；加入溶血素500 μl，震蕩混勻10 s，避光靜置10 min；加入500 μl鞘液，震蕩混勻10 s，避光靜置5 min；500 r/min離心5 min，棄上清，用濾紙吸干管壁液體；最后加入500 μl鞘液，震蕩混勻10 s，上機(jī)檢測。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞比值 取流式管并用移液器在其底部分別加入CD3-FITC/CD(16+56)-PE抗體20 μl、CD19-APC抗體10 μl、CD45-PerCP抗體10 μl，然后加入100 μl全血，震蕩混勻10 s，避光靜置15 min；其余步驟同T淋巴細(xì)胞亞群測定。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子濃度 將捕獲微球混合液，漩渦震蕩3～5 s，以每個樣本25 μl標(biāo)準(zhǔn)取于試管中并標(biāo)記，1 800 r/min離心5 min后棄掉上清，再取等量微球緩沖液重懸微球，漩渦震蕩3～5 s后避光孵育30 min;將標(biāo)準(zhǔn)品管轉(zhuǎn)移至試管，加入2 μl樣本稀釋液，靜置15 min，并標(biāo)記為最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度；取 10只試管，標(biāo)記為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、0(即陰性對照)，每管加入 300 μl樣品稀釋液;從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品管中吸取 300 μl樣本至 1∶2 管，吹打混勻，再從1∶2管中取 300 μl樣品至 1∶4 管，吹打混勻，如此類推，直到 1∶512管;0管加入300 μl磷酸鹽緩沖液(PBS);取上樣管，依次標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品管、陰性對照、樣本管，按說明書對應(yīng)關(guān)系依次放置；標(biāo)準(zhǔn)品管中加入25 μl對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照管中加入25 μl陰性對照樣本，樣本管中各加入 25 μl待檢測樣；向所有標(biāo)準(zhǔn)品管及樣品管中分別加入25 μl熒光檢測試劑;將孵育好的捕獲微球震蕩混勻后，向所有標(biāo)準(zhǔn)品管及樣品管中分別加入25 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育2.5 h。孵育完成后，每管加入 1 ml PBS 洗滌，1 800 r/min離心5 min，棄上清，每管再加入 100 μl PBS，震蕩重懸后上機(jī)檢測。將上機(jī)所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入 FCAP3.0.1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測得待檢測樣本結(jié)果。

1.3.5ALA-PDT治療疣體 用溫敏凝膠將 ALA 粉末稀釋成20%新鮮溶液。常規(guī)消毒清潔患處(尤其宮頸陰道、直腸內(nèi))，將滅菌棉片或棉條沾滿藥液敷于皮損處，然后紗布、保鮮膜封包、膠布固定3 h。用ALA-PDT治療儀局部照射20 min，光板距離皮膚2～6 cm；光纖外用套管，根據(jù)皮損部位和患者耐受情況不同，能量密度設(shè)定60～100 mW/cm2。囑患者保持體位，閉上雙眼，帶好專用防護(hù)眼鏡，勿移動身體，密切觀察局部皮膚反應(yīng)和患者有無不適。每周1次治療，連續(xù)治療3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組ALA-PDT治療前、后外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較 治療前CA組總T、CD4+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+值、細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ濃度均低于健康對照組，且復(fù)發(fā)組低于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；但CD8+百分比、IL-10和TNF-α濃度高于健康對照組，且復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。ALA-PDT治療后比較CA組總T、CD4+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+值、細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ濃度均有所升高，但仍低于健康對照組(均P<0.05)，初發(fā)、復(fù)發(fā)兩組上述指標(biāo)中除細(xì)胞因子IFN-γ濃度無顯著差異外(均P>0.05)，其余指標(biāo)復(fù)發(fā)組仍低于初發(fā)組(均P<0.05)；CD8+百分比、IL-10和TNF-α濃度有所下降，但仍高于健康對照組，且復(fù)發(fā)組仍高于初發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1、表2。

2.2ALA-PDT治療后有無皮疹比較 有皮疹組總T、CD4+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+值、細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ濃度仍低于無皮疹組(P均<0.05)，CD8+百分比、IL-10和TNF-α濃度仍高于無皮疹組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但無皮疹組總T百分比、細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10濃度與健康對照組比較無明顯差異(P均>0.05)，見表1、表2。

表1 各組治療前后外周血淋巴細(xì)胞比值

表2 各組治療前后外周血細(xì)胞因子濃度

2.3ALA-PDT治療效果 ALA-PDT治療后CA患者皮疹完全消退率70.53%；有22例未堅(jiān)持治療而失訪，占比18.80%，其中初發(fā)組17例、復(fù)發(fā)組5例。

2.4不良反應(yīng) 治療過程中有10例出現(xiàn)局部潰爛、感染不良反應(yīng)，通過局部處理后傷口痊愈，占比8.55%。

3 討 論

近年來我國CA發(fā)病一直維持在較高水平〔4〕，并且老年CA患者逐年增多，且其皮疹嚴(yán)重、發(fā)病時間長、治療依從性差，造成復(fù)發(fā)率高、治療周期延長。

人外周血淋巴細(xì)胞由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞組成。T細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，包括CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞，正常情況下CD4+/CD8+值>1。其中CD4+T細(xì)胞因能分泌多種細(xì)胞因子，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，分泌IL-4、IL-6、IL-10，主要調(diào)節(jié)體液免疫功能。CD8+T細(xì)胞屬直接效應(yīng)細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞輔助下，可以直接清除病毒感染細(xì)胞、胞內(nèi)菌感染細(xì)胞、支原體、衣原體、腫瘤細(xì)胞等。B細(xì)胞主要參與體液免疫，依靠產(chǎn)生的抗體與抗原結(jié)合后，為NK細(xì)胞識別而發(fā)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)作用，而且補(bǔ)體也可以與抗原抗體結(jié)合物引起吞噬細(xì)胞殺死病原體。NK細(xì)胞也屬于直接效應(yīng)細(xì)胞，參與非特異性免疫應(yīng)答，可以直接清除病毒感染細(xì)胞、胞內(nèi)菌感染細(xì)胞、支原體、衣原體、腫瘤細(xì)胞等，也可以在B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體輔助下殺死以上病原體。因此通過測定外周血淋巴細(xì)胞百分比及細(xì)胞因子濃度，可以了解患者免疫狀態(tài)。

研究表明CA發(fā)病、復(fù)發(fā)主要與患者細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，有學(xué)者在CA 患者疣體組織中發(fā)現(xiàn)免疫抑制相關(guān)或免疫異常分子〔5,6〕，而且患者外周血細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞也出現(xiàn)異?！?～9〕。老年人本身基礎(chǔ)代謝率降低，免疫功能下降，更容易患病毒、細(xì)菌、真菌等感染性疾病〔10～12〕，而且患病后免疫功能變化更加復(fù)雜，直接影響疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸〔13,14〕。

ALA-PDT治療中光敏劑吸收特定波長的光線后將疣體內(nèi)的氧分子激活為具有較高能量的單線態(tài)氧，后者在從高能態(tài)回歸到基態(tài)的過程中釋放的能量，引起增生的角質(zhì)形成細(xì)胞程序性死亡〔15〕，導(dǎo)致疣體壞死、脫落以達(dá)治療目的；同時也可通過激活T淋巴細(xì)胞增強(qiáng)了CA患者局部免疫功能〔16〕，減少復(fù)發(fā)。ALA-PDT治療作為目前治療CA重要方法之一，有效性及安全性已經(jīng)得到學(xué)者和臨床醫(yī)師廣泛認(rèn)可〔17～19〕。本研究也顯示3次ALA-PDT治療后老年CA患者皮疹消退率高達(dá)70.53%，療效確切。但同時不良反應(yīng)也有增加，達(dá)8.55%，且費(fèi)用相對偏高，因經(jīng)濟(jì)原因影響部分老年CA患者治療依從性，失訪率高達(dá)18.80%。

本研究結(jié)果說明老年CA患者患病時免疫功能整體趨勢是降低的，但同時也是有選擇性的，有利于清除病毒感染的指標(biāo)不同程度升高，包括可以直接清除病毒感染細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞 ；活化吞噬細(xì)胞、抗病毒的TNF-α；增強(qiáng)B細(xì)胞分化的IL-10。

本研究結(jié)果說明治療后整體免疫功能有所改善，但仍不及同年齡組健康人群。ALA-PDT治療后皮疹完全消退組患者的免疫功能包括細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫改善顯著，但也是有選擇性的。

綜上，外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子的變化可能與老年CA發(fā)病、復(fù)發(fā)密切相關(guān)；ALA-PDT可以有效治療老年CA，外周血淋巴細(xì)胞比例及細(xì)胞因子濃度變化可能是其機(jī)制之一。但ALA-PDT治療、CA皮疹消退及外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子的變化三者間確切的因果關(guān)系需要進(jìn)一步研究。