類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展

夏 晴，紀(jì)羽婷，劉海亮，宋武琦

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，伍連德研究所，黑龍江省免疫與感染重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江省普通高校病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為持續(xù)性滑膜炎、全身性炎癥，伴有骨骼和軟骨侵蝕，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直和畸形[1]。我國(guó)RA患病率約為0.32%～0.36%，在自然病程中，10年致殘率可超過60%[2]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型被廣泛用于發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究。目前已經(jīng)建立多種動(dòng)物模型用于研究RA的病因、發(fā)病機(jī)制、影響因素以及新的治療靶點(diǎn)的研究和新療法的評(píng)估，包括佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型(adjuvent induced arthritis，AA)、II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(collagen induced arhritis，CIA)、鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix proteins，COMP)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(pristane induced arthritis，PIA)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎模型。這些模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，但CIA一直是RA研究最廣泛的模型。將上述中因誘導(dǎo)產(chǎn)生的模型稱為誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型，另一類為基因工程型動(dòng)物模型，按照這兩大類來進(jìn)行介紹。

1 誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型

佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型最初由細(xì)菌學(xué)家Freund于五十年代創(chuàng)立，又稱弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎。使用弗氏佐劑單次皮下注射可誘導(dǎo)Wistar大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，并且多次注射發(fā)病率高于單次注射[3]。發(fā)病快，在很短的時(shí)間內(nèi)就可觀察到病變，可觀察到腳踝、爪子、尾巴的腫脹，累及單個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)；組織學(xué)可觀察到血管翳的形成、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，有軟骨和軟骨下骨侵蝕，隨后伴有關(guān)節(jié)強(qiáng)直，病變多持續(xù)14～45 d，觀察不到慢性活動(dòng)期。隨后，Trentham等[4]在1977年提出，通過背部皮下注射II型膠原與完全或不完全弗氏佐劑混合物，可誘導(dǎo)10～24周齡大的遠(yuǎn)系雜交Wistar 雌鼠、SD大鼠、近交系Wistar-Lewis大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎。病變主要累及遠(yuǎn)端踝關(guān)節(jié)、跗關(guān)節(jié)和趾間關(guān)節(jié)；嚴(yán)重程度峰值出現(xiàn)在發(fā)病后4 d內(nèi)，腫脹維持5～8周，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形。無論是異源或同源型II型膠原作為免疫原，還是采用完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)或不完全弗氏佐劑(incomplete freund’s adjuvant，ICFA)作為免疫原，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床特征是相似的，大鼠對(duì)同源或異源的II型膠原具有同樣的易感性[4]。1980年Courtenay等[5]提出使用II型膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型。通過背部皮下注射牛II型膠原在近交系8～15周齡DBA/1小鼠中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，多在免疫后23 d后發(fā)病，早期觀察到滑膜及其周圍組織水腫，接著伴隨滑膜增生，單核細(xì)胞浸潤(rùn)；病變后期，細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫減輕，有關(guān)節(jié)強(qiáng)直，可見滑膜和關(guān)節(jié)軟骨破壞，椎體很少受累，少數(shù)動(dòng)物的耳朵或尾巴偶見小的炎性病灶[5]。在刺激前后給予小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可誘導(dǎo)疾病發(fā)生得更快，起病變異性更小[6]。II型膠原誘導(dǎo)的大小鼠關(guān)節(jié)炎的主要病變相似，且均與人類RA有許多相似之處。但二者免疫不同，DBA/1小鼠初次免疫必須使用完全弗氏佐劑而不是不完全弗氏佐劑，CIA誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎起病慢，病程長(zhǎng)[7]。近年來，CIA模型在基于生物學(xué)的新療法的測(cè)試和開發(fā)中發(fā)揮了重要作用，如針對(duì)TNF-α的治療[8]。

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的易感性與主要組織相容復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)的特定II類分子如H-2r 和 H-2q有關(guān)，同樣，人RA的易感性也與MHC II類分子H-2r 和 H-2q相關(guān)。在這兩種疾病中，都有針對(duì)CII和類風(fēng)濕的自身抗體產(chǎn)生的因素，有證據(jù)表明，RA患者的抗體針對(duì)的是與CIA相同的CII分子區(qū)域[9-10]。

大鼠對(duì)佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎異常敏感，除了使用弗氏佐劑以外，非免疫原性佐劑如降植烷、角鯊烯均可以在大鼠品系中誘發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，且符合RA的標(biāo)準(zhǔn)[11]。大鼠單次皮下注射降植烷可以誘導(dǎo)PIA，小鼠需要注射兩次降植烷，時(shí)間間隔為50 d，然后是慢性復(fù)發(fā)期，該炎癥為T細(xì)胞依賴型，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎癥的一個(gè)延長(zhǎng)、延遲的臨床時(shí)間過程；組織學(xué)變現(xiàn)為滑膜增生、軟骨和骨糜爛、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成；可以檢測(cè)到類風(fēng)濕因子，熱休克蛋白和I、II型膠原抗體也被檢測(cè)到。非免疫原性佐劑關(guān)節(jié)炎表明，非特異性的免疫系統(tǒng)刺激可以引發(fā)關(guān)節(jié)炎。DA系大鼠對(duì)PIA最敏感，發(fā)病率可達(dá)100%，E3系最不敏感，發(fā)病率為0[12]。降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型對(duì)TNF-α抑制劑療法不敏感，因此該模型可用于研究除TNF-α抑制劑療法以外的新方法，對(duì)于研究對(duì)TNF-α抑制劑療法無效的患者的相關(guān)治療方法是有重要意義的[13]。

COMP是一種軟骨特異性分子，可在幾種大鼠以及小鼠品系中誘發(fā)急性和自限性關(guān)節(jié)炎[14-15]，天然和變性COMP均可在大鼠中誘發(fā)嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，病變變現(xiàn)為滑膜中度增生、肥大，伴血管翳形成。雖然骨和軟骨的破壞是明顯存在的，但它們僅限于邊緣區(qū)，而整個(gè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)只是偶爾被重塑。多數(shù)情況下，關(guān)節(jié)炎是逐漸愈合的，免疫后43 d沒有炎癥或畸形的跡象。疾病具有自限性，很容易在對(duì)CIA以及佐劑模型具有抗性的E3品系中誘導(dǎo)，這種差異不僅與RT1u單倍型有關(guān)，也與非MHC基因有關(guān)，表明，COMP依賴于獨(dú)特的疾病途徑。與天然COMP免疫誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎類似，變性COMP免疫誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，但它往往更持久，特別是在E3品系。

研究發(fā)現(xiàn)[16]，II型膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎，其血清經(jīng)50%硫酸銨分級(jí)濃縮后，轉(zhuǎn)移至正常受體內(nèi)，在18～72 h后可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，并且可以表現(xiàn)出早期炎癥病變的所有病理組織學(xué)特征，如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但是炎癥短暫、不嚴(yán)重。轉(zhuǎn)移的血清中含有活性的IgG抗膠原蛋白抗體。該種方法所致關(guān)節(jié)炎為快速發(fā)病，疾病高峰期在8 d以內(nèi)，而且具有高度的同步性，而CIA，在疾病的發(fā)生率、同步性和分布方面存在很大的個(gè)體差異。該方法還適用于免疫一些不適合進(jìn)行CIA免疫的小鼠品系。

在誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型的多種方法中(見圖1)，AA操作方法簡(jiǎn)單，但是缺乏慢性病過程，病變具有一定的自限性，在病理生理學(xué)特點(diǎn)上存在較大差距；CIA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)病時(shí)間與臨床表現(xiàn)不一，雖然與人類RA有很多相似之處，但是無病情波動(dòng)和復(fù)發(fā)情況，沒有類風(fēng)濕因子及抗核抗體，但它已經(jīng)是目前公認(rèn)的研究RA最佳模型，特別是在治療機(jī)制及免疫反應(yīng)有關(guān)的研究中；降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型耗時(shí)久，該模型主要依賴T細(xì)胞激活，主要用來藥物驗(yàn)證；COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)病較AA要快，起病急，病程短，雖然其外周關(guān)節(jié)病變?cè)谂R床上與RA相似，但不產(chǎn)生永久的關(guān)節(jié)破壞[17]。

重點(diǎn)介紹AA、CIA、PIA以及COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎其發(fā)病機(jī)制和主要病變可見表1[18-29]。

圖1 關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)流程圖Figure 1 Arthritis induction flow chart

2 基因工程型關(guān)節(jié)炎模型

小鼠在經(jīng)過一定的基因修飾后可以自發(fā)形成關(guān)節(jié)炎，與依賴多基因性狀相比，靶向基因工程使自發(fā)性疾病模型的定義更狹窄，更簡(jiǎn)單，也可進(jìn)一步了解細(xì)胞因子在RA發(fā)展中的作用，下面介紹幾種基因修飾后的自發(fā)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，如表 2所示。

通過RA患者分離的滑膜細(xì)胞進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)物腫瘤壞死因子(TNF-α)通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)，在關(guān)節(jié)炎癥中起中心作用[30-32]。1991年構(gòu)建人類TNF轉(zhuǎn)基因小鼠[33]，表現(xiàn)出人類TNF基因表達(dá)的失調(diào)模式，可發(fā)展為慢性炎性多關(guān)節(jié)炎，并且觀察到與人類RA相一致的組織學(xué)特征，滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在不同的發(fā)育階段都很明顯；血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨破壞和大量纖維組織產(chǎn)生，與人類RA相一致的組織學(xué)特征，在疾病晚期被觀察到。該研究也證明了在轉(zhuǎn)基因小鼠中可以建立正確的、內(nèi)毒素應(yīng)答的和巨噬細(xì)胞特異性的人類TNF基因表達(dá)，并證明了人類TNF基因的3′-區(qū)域可能參與了巨噬細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄。隨后研究發(fā)現(xiàn)[34]，在C57B1/6 CBA小鼠的背景下，與BDA/1反向雜交產(chǎn)生一種TNF過表達(dá)的小鼠，其關(guān)節(jié)炎發(fā)病比前者要嚴(yán)重，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)病加速，且持續(xù)幾代，就是說第一代發(fā)病在8～9周，意味著第11代可能是在第三周或者出生后11 d就發(fā)病。這些小鼠關(guān)節(jié)中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可表明，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和隨后的關(guān)節(jié)損傷至少部分是通過成纖維細(xì)胞的TNF-α的異常表達(dá)產(chǎn)生的。通過體內(nèi)注射人類TNF抗體可以預(yù)防小鼠中關(guān)節(jié)炎的發(fā)生并治療已發(fā)生的關(guān)節(jié)炎，這些結(jié)果為TNF在炎癥性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用提供了直接證據(jù)。抑制TNF可能被證明在設(shè)計(jì)這類疾病的治療方案中是有用的。

白介素-1(interleukin 1，IL-1)作為一種促炎因子，也參與人類RA的疾病進(jìn)展，IL-1似乎特別重要，因?yàn)閷L-1注入正常兔關(guān)節(jié)會(huì)引起嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎[35]，并且將抗IL-1抗體或IL-1受體拮抗劑(ra)注入受影響的關(guān)節(jié)會(huì)改善疾病[36-38]。IL-1受體拮抗劑(ra)是其內(nèi)源性抑制劑，為了闡明IL-1ra的作用，通過基因靶向構(gòu)建IL-1ra缺陷型小鼠，IL-1ra缺陷小鼠是通過將分泌型的整個(gè)外顯子與neo基因進(jìn)行同源重組而產(chǎn)生的[39]。在這些突變小鼠中，IL-1ra的四種亞型均被破壞。這些小鼠與BALB/cA或C57BL/6J品系小鼠回交5～8代，與BALB/cA小鼠回交5代后，IL-1ra-/-小鼠自發(fā)發(fā)展為慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎，后肢的踝關(guān)節(jié)處的腫脹和發(fā)紅最為明顯，前肢的關(guān)節(jié)也發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，發(fā)生率和嚴(yán)重性較低；組織學(xué)分析顯示滑膜和關(guān)節(jié)周圍炎癥；可看到包括淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在內(nèi)的炎性細(xì)胞的入侵形成了血管翳，骨侵蝕也很明顯[40]。研究表明IL-1ra基因的缺乏會(huì)引起自身免疫性疾病和關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)調(diào)IL-1/IL-1ra平衡在維持關(guān)節(jié)正常生理和免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面的重要性。除此之外，發(fā)現(xiàn)C57BL/6J背景下的IL-1ra-/-小鼠在II型膠原免疫時(shí)發(fā)生關(guān)節(jié)炎的幾率很高，這表明IL-1ra-/-小鼠的免疫系統(tǒng)具有高反應(yīng)性，我們還觀察到該疾病在DBA/1背景下的早期發(fā)病和更嚴(yán)重的表型[40]。

表1 誘導(dǎo)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物Table 1 Induced rheumatoid arthritis animals

研究發(fā)現(xiàn)[41]，編碼T細(xì)胞中一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，ZAP-70 SH2結(jié)構(gòu)域的基因發(fā)生了自發(fā)的點(diǎn)突變，導(dǎo)致BALB/c小鼠的慢性自身免疫性關(guān)節(jié)炎，稱為SKG關(guān)節(jié)炎模型。小鼠在2個(gè)月大時(shí)開始發(fā)病，X線檢查顯示，在8～12個(gè)月大時(shí)，軟骨下骨破壞和融合、關(guān)節(jié)脫位和骨質(zhì)疏松癥。

除此之外還包括K/BxN模型[42]、Human/SCID嵌合體小鼠模型[42]和Human DR4-CD4小鼠模型[43]等。K/BxN模型小鼠關(guān)節(jié)炎屬于慢性進(jìn)行性疾病，首先表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹，并發(fā)展到多個(gè)關(guān)節(jié)畸形嚴(yán)重?fù)p害活動(dòng)能力的程度，關(guān)節(jié)受累明顯對(duì)稱，并顯示出明顯的遠(yuǎn)端突出；組織學(xué)分析揭示了大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜炎，血管翳形成，軟骨破壞，骨質(zhì)侵蝕繼而重塑和纖維化[42]。基因工程型關(guān)節(jié)炎模型更有助于研究某一特定因子或者基因在關(guān)節(jié)炎疾病中的作用，模型具有遺傳性，可以在后代中持續(xù)表達(dá)。

表 2 基因工程型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型Table 2 Genetically engineered rheumatoid arthritis model

3 結(jié)語

近年來，人們對(duì)于關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的研究逐漸增多，模型構(gòu)建方法也從誘導(dǎo)型發(fā)展至基因工程修飾的小鼠動(dòng)物品系。對(duì)動(dòng)物模型的不斷深入研究，對(duì)于RA的發(fā)病機(jī)制、影響因素以及治療方法等多方面都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。多種類的動(dòng)物模型，也使得研究更加精準(zhǔn)，尤其新的基因工程模型，為一些靶點(diǎn)藥物研究提供了新思路。雖然目前對(duì)RA動(dòng)物模型的研究較為廣泛，但模型都是在特定的條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，不能完全反應(yīng)RA疾病過程中的所有影響因素，而且動(dòng)物模型側(cè)重于嚙齒類動(dòng)物，與人類還存在較大的種屬差異。所以研究出一種種屬與人類更貼近，操作更為便捷、經(jīng)濟(jì)，更加全面反應(yīng)人類RA疾病進(jìn)展的動(dòng)物模型是今后研究RA動(dòng)物模型的重要內(nèi)容之一。