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    高強(qiáng)度聚焦超聲對宮頸癌大鼠免疫功能及生存時間的影響

    2020-12-09 06:57:12彭月享高衛(wèi)元黃紅麗
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:造模外周血淋巴細(xì)胞

    黃 敏,彭月享,高衛(wèi)元,黃紅麗

    (1.武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 超聲科,武漢 430000; 2.武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 婦產(chǎn)科,武漢 430000)

    宮頸癌早期常無明顯癥狀和體征,主要采用外科手術(shù)治療,中晚期主要表現(xiàn)為不規(guī)則陰道流血、陰道排液等,嚴(yán)重者可表現(xiàn)為貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀,主要采用放射治療或化療,但其治療效果并不十分令人滿意[1]。高強(qiáng)度聚焦超聲治療(high intensity focused ultrasound,HIFU)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的腫瘤治療方法,利用高強(qiáng)度超聲波聚焦后,穿透到人體內(nèi),殺滅靶區(qū)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞,還可能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),提高患者的免疫功能,從而達(dá)到治療腫瘤的目的[2]。已有研究顯示,HIFU可以用于臨床晚期胰腺癌[3]、子宮肌瘤[4]、宮頸癌[5]等的治療,延長患者的生存期,且毒副反應(yīng)小。但HIFU治療宮頸癌研究報(bào)道較少,殺滅腫瘤細(xì)胞的機(jī)理尚不明確,對宮頸癌患者免疫功能的影響亦尚不清楚。因此,本研究探索了HIFU對宮頸癌大鼠免疫功能和生存時間的影響,旨在為HIFU在宮頸癌治療中的應(yīng)用提供一定的理論支撐。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    60只6~8周齡Wistar大鼠,清潔級雌性,體重均為160~200 g,由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供[SCXK(鄂)2015-0018],經(jīng)武漢市第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20170119-03),飼養(yǎng)于本院動物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(鄂)2019-0080],保持室溫恒定為25℃,模擬晝夜光照,自由攝食與飲水,嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動物3R原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道主義關(guān)懷。

    1.2 主要試劑與儀器

    FACSCanto II流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;全自動酶標(biāo)儀購自Thermo Scientific公司;人宮頸癌HeLa細(xì)胞由上海鈺博生物科技有限公司提供,接種于含有100 U/mL青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 動物造模與給藥

    大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為對照組、模型組和HIFU組,每組20只,每組隨機(jī)選取10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化,剩余10只用于病理、免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測。模型組和HIFU組采用左側(cè)腋窩處皮下注射人宮頸癌HeLa細(xì)胞建立宮頸癌大鼠模型[6],均經(jīng)左側(cè)腋窩處皮下注射接種人宮頸癌HeLa細(xì)胞(0.5 mL,1×107/mL),密切觀察,肉眼可見大鼠左腋窩處有明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長即為造模成功,對照組于左側(cè)腋窩處皮下注射等體積生理鹽水。造模后第7天,HIFU組進(jìn)行局部HIFU治療,輻照強(qiáng)度為2.3 MPa,單點(diǎn)單次治療時間為10 s,共250 s,對照組和模型組治療程序與HIFU治療相同,但功率源開關(guān)關(guān)閉。對照組、模型組和HIFU組20只大鼠中,10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化,于造模之日開始觀察,觀察時間共9周;剩余10只大鼠于治療后14 d立即處死,分離大鼠的血液,無菌剝離移植瘤組織,分離大鼠脾,用于病理及免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測。

    1.3.2 觀察各組大鼠的生存時間

    于造模之日開始觀察大鼠的生存狀態(tài),記錄各組大鼠9周內(nèi)的生存狀態(tài)(生存或死亡),分別于造模前、造模后1周給藥即刻、造模3周、造模5周和造模7周稱取大鼠的體重。

    1.3.3 觀察各組大鼠的移植瘤體積和重量

    處死大鼠后,剝離大鼠移植瘤組織,測移植瘤長徑、短徑,計(jì)算其腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2,同時稱取移植瘤重量,計(jì)算HIFU的抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織重量/對照組腫瘤組織重量)×100%。

    1.3.4 HE染色觀察大鼠移植瘤組織病理變化

    采集大鼠移植瘤組織,進(jìn)行常規(guī)切片制作和HE染色,顯微鏡下觀察移植瘤組織的病理變化。

    1.3.5 MTT檢測脾淋巴細(xì)胞活力

    取各組大鼠脾組織,剪碎研磨,過濾,離心(1500 r/min,10 min),棄上清,加入10 mL氯化銨37℃水浴10 min,加入2 mL的RPMI 1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),采用臺盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95%以上,制備成脾淋巴細(xì)胞液。將脾淋巴細(xì)胞懸液以每毫升1×105個接種于96孔培養(yǎng)板,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),分別于0 h、24 h、48 h、72 h,進(jìn)行MTT檢測,酶標(biāo)儀測定波長為570 nm處的吸光度值(OD570),繪制細(xì)胞生長曲線,嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

    1.3.6 流式細(xì)胞儀分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群

    分離腹主動脈血液,抗凝離心(3000 r/min,5 min),棄上清,室溫避光孵育30 min,加紅細(xì)胞裂解液作用15 min,加70%乙醇混合,4℃靜置48 h,棄上清,采用1 mL PBS 重懸,加入5 μL濃度為10 mg/mL的RNase,37℃下孵育1 h,分別加入相應(yīng)的流式抗體(CD4-APC,CD8-PE),室溫避光孵育30 min,上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞比例。

    1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞凋亡

    分離腹主動脈血液,抗凝離心(3000 r/min,5 min),采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞,PBS重懸后,收集各組細(xì)胞,采用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化,離心(3000 r/min,5min),用冷PBS洗滌,以每毫升1×105個接種于6孔板,采用Annexin V-FITC/PI試劑盒染色,上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 HIFU對各組大鼠生存時間的影響

    生存分析結(jié)果顯示,模型組大鼠于造模后43 d開始出現(xiàn)死亡,HIFU組大鼠于造模后46 d開始出現(xiàn)死亡;與模型組相比,HIFU組的中位生存時間明顯延長[(54.51±3.16) vs (48.03±1.05),Log Rank χ2=7.504,P=0.006],見圖1。

    圖1 各組大鼠的生存曲線比較Figure 1 Comparison of survival curves of rats in each group

    2.2 HIFU對各組大鼠體重的影響

    造模前各組大鼠的體重均無明顯差異(P>0.05);與對照組相比,模型組和HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯下降(P<0.05);與模型組相比,HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯升高(P<0.05),見表1。

    2.3 HIFU對各組大鼠移植瘤體積和重量的影響

    與模型組相比,HIFU組的腫瘤體積和重量明顯降低(P<0.05),HIFU的抑瘤率為35.25%,見表2。

    2.4 各組大鼠移植瘤組織的病理變化

    HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠移植瘤組織細(xì)胞呈橢圓形,胞核呈兩個或多個,結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)未見異常;HIFU組大鼠移植瘤組織細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)固縮,出現(xiàn)片狀壞死區(qū),見圖2。

    2.5 HIFU對各組大鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響

    MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組和HIFU組脾淋巴細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05);與模型組相比,HIFU組脾淋巴細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05),見圖3。

    2.6 HIFU對各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T細(xì)胞水平的影響

    流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組和HIFU組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯下降(P<0.05);與模型組相比,HIFU組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯升高(P<0.05),見表3。

    2.7 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組和HIFU組T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與模型組相比,HIFU組T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05),見圖4、表4。

    表1 HIFU對各組大鼠體重的影響Table 1 Effect of HIFU on body weight of rats in each group

    表2 各組大鼠移植瘤的體積和重量Table 2 Volume and weight of transplanted tumor in each group

    圖2 各組大鼠移植瘤組織的病理變化(HE染色)Figure 2 Pathological changes of transplanted tumor tissues in each group of rats (HE staining)

    注:與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖3 HIFU對各組大鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響Note. Compared with control group,*P < 0.05. Compared with model group,#P < 0.05.Figure 3 Effect of HIFU on spleen lymphocyte activity in each group

    表3 各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T 細(xì)胞水平

    圖4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴 細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of HIFU on T lymphocyte apoptosis in peripheral blood of rats in each group

    表4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞凋亡的

    3 討論

    宮頸癌是常見的女性三大惡性腫瘤之一,臨床主要采用外科手術(shù)聯(lián)合放化療,預(yù)后較差[7]。HIFU是一種新型的非侵入性治療手段,可以將超聲波進(jìn)行聚焦后,安全地將能量密度較低的超聲波匯聚至靶區(qū),利用焦點(diǎn)處超聲波的熱效應(yīng),使靶區(qū)組織細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷,達(dá)到抗腫瘤的作用[8]。目前,HIFU已被用于前列腺癌、乳腺癌、軟組織腫瘤以及子宮腺肌癥等多種疾病的治療[9],但對宮頸癌的作用研究報(bào)道較少。因此,本研究分析了HIFU對宮頸癌大鼠生存時間的影響。本研究中,HIFU作用后可明顯延長宮頸癌大鼠的生存時間,提示HIFU可能通過抗腫瘤作用,延長大鼠的生存時間。許濤等[10]的研究顯示,HIFU可用于晚期宮頸癌患者的治療,減少局部復(fù)發(fā),提示HIFU對宮頸癌具有的一定的抗腫瘤作用,有望應(yīng)用于臨床。本研究中,HIFU作用后可明顯改善宮頸癌大鼠的體重,誘導(dǎo)腫瘤組織壞死,減少移植瘤體積和重量。Hectors等[11]的研究顯示,HIFU可以將超聲波能量匯聚于腫瘤組織,通過熱效應(yīng),使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死,提示HIFU可能通過破壞宮頸癌腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死,發(fā)揮其抗腫瘤作用,延長大鼠的生存時間。

    細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤的主要機(jī)制,腫瘤細(xì)胞可通過改變細(xì)胞表面抗原、降低或不表達(dá)組織相容性抗原Ⅰ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ、分泌多種免疫抑制因子等多種途徑,發(fā)生免疫逃避或免疫抑制,發(fā)生惡性增殖[12]。本研究中,宮頸癌大鼠的脾淋巴細(xì)胞活力明顯下降,HIFU作用后可明顯提高大鼠的脾淋巴細(xì)胞活力。脾是機(jī)體最大免疫系統(tǒng)中的最主要的免疫器官之一,含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,可以清除血細(xì)胞抗原和異物,是機(jī)體免疫系統(tǒng)的中心,脾淋巴細(xì)胞增殖活性可以反應(yīng)機(jī)體淋巴細(xì)胞的功能[13]。許濤等[14]的研究顯示,HIFU可以改善原發(fā)性肝癌的免疫功能,延長患者的生存時間,提示HIFU可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死,抑制腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子,提高脾淋巴細(xì)胞活力,提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和抗腫瘤能力,從而延長宮頸癌大鼠的生存時間。

    本研究中,宮頸癌大鼠的外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯下降,HIFU作用后可明顯提高大鼠外周血。T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要免疫細(xì)胞,按功能可分為輔助T細(xì)胞(T helper cells,Th)、記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T cells,Tc)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)和抑制性T細(xì)胞(suppressor T cell,Ts)[15]。CD4+T 細(xì)胞主要為Th細(xì)胞,CD4分子主要與MHC-Ⅱ分子相結(jié)合,CD8分布于Tc細(xì)胞及Ts細(xì)胞表面,可以與MHC-Ⅰ分子結(jié)合,共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[16]。Th細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子,促進(jìn)其他T細(xì)胞的分化成熟,在協(xié)助誘導(dǎo)細(xì)胞免疫中具有重要作用,還可以輔助B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞,協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,Tc細(xì)胞主要通過分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用,清除病毒、腫瘤等靶細(xì)胞,Ts細(xì)胞則能抑制Th細(xì)胞,負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[17-18]。已有研究顯示[19],CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值可反映機(jī)體的整體免疫功能,提示HIFU作用后,可明顯改善宮頸癌大鼠降低的免疫功能。本研究中,宮頸癌大鼠的外周血T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高,HIFU作用后可明顯降低T淋巴細(xì)胞凋亡率。已有研究顯示[20],腫瘤細(xì)胞可通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡,發(fā)生免疫逃避或免疫抑制,進(jìn)行惡性增殖,提示HIFU作用可能通過破壞宮頸癌腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡,改善機(jī)體的免疫功能,抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃避或免疫抑制,提高其抗腫瘤作用。

    綜上所述,HIFU可以明顯升高大鼠的CD4+T細(xì)胞、CD8+T的數(shù)量以及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值,提高脾淋巴細(xì)胞活力,改善大鼠降低的免疫功能,延長宮頸癌大鼠的生存時間,但HIFU調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的具體機(jī)制尚不明確,需進(jìn)一步深入研究探索。

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