高強(qiáng)度聚焦超聲對宮頸癌大鼠免疫功能及生存時間的影響

黃 敏，彭月享，高衛(wèi)元，黃紅麗

(1.武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 超聲科，武漢 430000； 2.武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū) 婦產(chǎn)科，武漢 430000)

宮頸癌早期常無明顯癥狀和體征，主要采用外科手術(shù)治療，中晚期主要表現(xiàn)為不規(guī)則陰道流血、陰道排液等，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀，主要采用放射治療或化療，但其治療效果并不十分令人滿意[1]。高強(qiáng)度聚焦超聲治療(high intensity focused ultrasound，HIFU)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的腫瘤治療方法，利用高強(qiáng)度超聲波聚焦后，穿透到人體內(nèi)，殺滅靶區(qū)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，還可能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，提高患者的免疫功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[2]。已有研究顯示，HIFU可以用于臨床晚期胰腺癌[3]、子宮肌瘤[4]、宮頸癌[5]等的治療，延長患者的生存期，且毒副反應(yīng)小。但HIFU治療宮頸癌研究報(bào)道較少，殺滅腫瘤細(xì)胞的機(jī)理尚不明確，對宮頸癌患者免疫功能的影響亦尚不清楚。因此，本研究探索了HIFU對宮頸癌大鼠免疫功能和生存時間的影響，旨在為HIFU在宮頸癌治療中的應(yīng)用提供一定的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只6～8周齡Wistar大鼠，清潔級雌性，體重均為160～200 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供[SCXK(鄂)2015-0018]，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20170119-03)，飼養(yǎng)于本院動物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(鄂)2019-0080]，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動物3R原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

FACSCanto II流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；全自動酶標(biāo)儀購自Thermo Scientific公司；人宮頸癌HeLa細(xì)胞由上海鈺博生物科技有限公司提供，接種于含有100 U/mL青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物造模與給藥

大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對照組、模型組和HIFU組，每組20只，每組隨機(jī)選取10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化，剩余10只用于病理、免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測。模型組和HIFU組采用左側(cè)腋窩處皮下注射人宮頸癌HeLa細(xì)胞建立宮頸癌大鼠模型[6]，均經(jīng)左側(cè)腋窩處皮下注射接種人宮頸癌HeLa細(xì)胞(0.5 mL，1×107/mL)，密切觀察，肉眼可見大鼠左腋窩處有明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長即為造模成功，對照組于左側(cè)腋窩處皮下注射等體積生理鹽水。造模后第7天，HIFU組進(jìn)行局部HIFU治療，輻照強(qiáng)度為2.3 MPa，單點(diǎn)單次治療時間為10 s，共250 s，對照組和模型組治療程序與HIFU治療相同，但功率源開關(guān)關(guān)閉。對照組、模型組和HIFU組20只大鼠中，10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化，于造模之日開始觀察，觀察時間共9周；剩余10只大鼠于治療后14 d立即處死，分離大鼠的血液，無菌剝離移植瘤組織，分離大鼠脾，用于病理及免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3.2 觀察各組大鼠的生存時間

于造模之日開始觀察大鼠的生存狀態(tài)，記錄各組大鼠9周內(nèi)的生存狀態(tài)(生存或死亡)，分別于造模前、造模后1周給藥即刻、造模3周、造模5周和造模7周稱取大鼠的體重。

1.3.3 觀察各組大鼠的移植瘤體積和重量

處死大鼠后，剝離大鼠移植瘤組織，測移植瘤長徑、短徑，計(jì)算其腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2，同時稱取移植瘤重量，計(jì)算HIFU的抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織重量/對照組腫瘤組織重量)×100%。

1.3.4 HE染色觀察大鼠移植瘤組織病理變化

采集大鼠移植瘤組織，進(jìn)行常規(guī)切片制作和HE染色，顯微鏡下觀察移植瘤組織的病理變化。

1.3.5 MTT檢測脾淋巴細(xì)胞活力

取各組大鼠脾組織，剪碎研磨，過濾，離心(1500 r/min，10 min)，棄上清，加入10 mL氯化銨37℃水浴10 min，加入2 mL的RPMI 1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，采用臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95%以上，制備成脾淋巴細(xì)胞液。將脾淋巴細(xì)胞懸液以每毫升1×105個接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h、72 h，進(jìn)行MTT檢測，酶標(biāo)儀測定波長為570 nm處的吸光度值(OD570)，繪制細(xì)胞生長曲線，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3.6 流式細(xì)胞儀分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群

分離腹主動脈血液，抗凝離心(3000 r/min，5 min)，棄上清，室溫避光孵育30 min，加紅細(xì)胞裂解液作用15 min，加70%乙醇混合，4℃靜置48 h，棄上清，采用1 mL PBS 重懸，加入5 μL濃度為10 mg/mL的RNase，37℃下孵育1 h，分別加入相應(yīng)的流式抗體(CD4-APC，CD8-PE)，室溫避光孵育30 min，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞比例。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞凋亡

分離腹主動脈血液，抗凝離心(3000 r/min，5 min)，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，PBS重懸后，收集各組細(xì)胞，采用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心(3000 r/min，5min)，用冷PBS洗滌，以每毫升1×105個接種于6孔板，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒染色，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HIFU對各組大鼠生存時間的影響

生存分析結(jié)果顯示，模型組大鼠于造模后43 d開始出現(xiàn)死亡，HIFU組大鼠于造模后46 d開始出現(xiàn)死亡；與模型組相比，HIFU組的中位生存時間明顯延長[(54.51±3.16) vs (48.03±1.05)，Log Rank χ2=7.504，P=0.006]，見圖1。

圖1 各組大鼠的生存曲線比較Figure 1 Comparison of survival curves of rats in each group

2.2 HIFU對各組大鼠體重的影響

造模前各組大鼠的體重均無明顯差異(P>0.05)；與對照組相比，模型組和HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.3 HIFU對各組大鼠移植瘤體積和重量的影響

與模型組相比，HIFU組的腫瘤體積和重量明顯降低(P<0.05)，HIFU的抑瘤率為35.25%，見表2。

2.4 各組大鼠移植瘤組織的病理變化

HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠移植瘤組織細(xì)胞呈橢圓形，胞核呈兩個或多個，結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)未見異常；HIFU組大鼠移植瘤組織細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)固縮，出現(xiàn)片狀壞死區(qū)，見圖2。

2.5 HIFU對各組大鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組脾淋巴細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組脾淋巴細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)，見圖3。

2.6 HIFU對各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T細(xì)胞水平的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯升高(P<0.05)，見表3。

2.7 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖4、表4。

表1 HIFU對各組大鼠體重的影響Table 1 Effect of HIFU on body weight of rats in each group

表2 各組大鼠移植瘤的體積和重量Table 2 Volume and weight of transplanted tumor in each group

圖2 各組大鼠移植瘤組織的病理變化(HE染色)Figure 2 Pathological changes of transplanted tumor tissues in each group of rats (HE staining)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖3 HIFU對各組大鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響Note. Compared with control group,*P < 0.05. Compared with model group,#P < 0.05.Figure 3 Effect of HIFU on spleen lymphocyte activity in each group

表3 各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T 細(xì)胞水平

圖4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴 細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of HIFU on T lymphocyte apoptosis in peripheral blood of rats in each group

表4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞凋亡的

3 討論

宮頸癌是常見的女性三大惡性腫瘤之一，臨床主要采用外科手術(shù)聯(lián)合放化療，預(yù)后較差[7]。HIFU是一種新型的非侵入性治療手段，可以將超聲波進(jìn)行聚焦后，安全地將能量密度較低的超聲波匯聚至靶區(qū)，利用焦點(diǎn)處超聲波的熱效應(yīng)，使靶區(qū)組織細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷，達(dá)到抗腫瘤的作用[8]。目前，HIFU已被用于前列腺癌、乳腺癌、軟組織腫瘤以及子宮腺肌癥等多種疾病的治療[9]，但對宮頸癌的作用研究報(bào)道較少。因此，本研究分析了HIFU對宮頸癌大鼠生存時間的影響。本研究中，HIFU作用后可明顯延長宮頸癌大鼠的生存時間，提示HIFU可能通過抗腫瘤作用，延長大鼠的生存時間。許濤等[10]的研究顯示，HIFU可用于晚期宮頸癌患者的治療，減少局部復(fù)發(fā)，提示HIFU對宮頸癌具有的一定的抗腫瘤作用，有望應(yīng)用于臨床。本研究中，HIFU作用后可明顯改善宮頸癌大鼠的體重，誘導(dǎo)腫瘤組織壞死，減少移植瘤體積和重量。Hectors等[11]的研究顯示，HIFU可以將超聲波能量匯聚于腫瘤組織，通過熱效應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，提示HIFU可能通過破壞宮頸癌腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，發(fā)揮其抗腫瘤作用，延長大鼠的生存時間。

細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤的主要機(jī)制，腫瘤細(xì)胞可通過改變細(xì)胞表面抗原、降低或不表達(dá)組織相容性抗原Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ、分泌多種免疫抑制因子等多種途徑，發(fā)生免疫逃避或免疫抑制，發(fā)生惡性增殖[12]。本研究中，宮頸癌大鼠的脾淋巴細(xì)胞活力明顯下降，HIFU作用后可明顯提高大鼠的脾淋巴細(xì)胞活力。脾是機(jī)體最大免疫系統(tǒng)中的最主要的免疫器官之一，含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可以清除血細(xì)胞抗原和異物，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的中心，脾淋巴細(xì)胞增殖活性可以反應(yīng)機(jī)體淋巴細(xì)胞的功能[13]。許濤等[14]的研究顯示，HIFU可以改善原發(fā)性肝癌的免疫功能，延長患者的生存時間，提示HIFU可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，抑制腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子，提高脾淋巴細(xì)胞活力，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和抗腫瘤能力，從而延長宮頸癌大鼠的生存時間。

本研究中，宮頸癌大鼠的外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯下降，HIFU作用后可明顯提高大鼠外周血。T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要免疫細(xì)胞，按功能可分為輔助T細(xì)胞(T helper cells，Th)、記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T cells，Tc)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)和抑制性T細(xì)胞(suppressor T cell，Ts)[15]。CD4+T 細(xì)胞主要為Th細(xì)胞，CD4分子主要與MHC-Ⅱ分子相結(jié)合，CD8分布于Tc細(xì)胞及Ts細(xì)胞表面，可以與MHC-Ⅰ分子結(jié)合，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[16]。Th細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)其他T細(xì)胞的分化成熟，在協(xié)助誘導(dǎo)細(xì)胞免疫中具有重要作用，還可以輔助B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞，協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，Tc細(xì)胞主要通過分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用，清除病毒、腫瘤等靶細(xì)胞，Ts細(xì)胞則能抑制Th細(xì)胞，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[17-18]。已有研究顯示[19]，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值可反映機(jī)體的整體免疫功能，提示HIFU作用后，可明顯改善宮頸癌大鼠降低的免疫功能。本研究中，宮頸癌大鼠的外周血T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高，HIFU作用后可明顯降低T淋巴細(xì)胞凋亡率。已有研究顯示[20]，腫瘤細(xì)胞可通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，發(fā)生免疫逃避或免疫抑制，進(jìn)行惡性增殖，提示HIFU作用可能通過破壞宮頸癌腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡，改善機(jī)體的免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃避或免疫抑制，提高其抗腫瘤作用。

綜上所述，HIFU可以明顯升高大鼠的CD4+T細(xì)胞、CD8+T的數(shù)量以及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，提高脾淋巴細(xì)胞活力，改善大鼠降低的免疫功能，延長宮頸癌大鼠的生存時間，但HIFU調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入研究探索。