辛伐他汀納米粒的構(gòu)建及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠作用的研究

韓金霞，朱亞南，王金文，王吉佳，李 迪，楊靜波

(大慶油田總醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 大慶 163000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)指血液內(nèi)脂質(zhì)物未及時(shí)排出沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜，久而久之所形成的粥糜樣壞死病灶[1-3]。AS是冠心病、腦梗死及外周血管病的早期征兆和病理基礎(chǔ)，因而有效預(yù)防和治療AS具有重要的臨床意義[4-5]。他汀類藥物，是目前臨床應(yīng)用的有效降脂藥物，主要用于治療高脂血癥。他汀類藥物不僅能強(qiáng)效地降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)，而且能一定程度上降低三酰甘油(TG)，還能升高高密度脂蛋白(HDL)，所以被公認(rèn)為為較全面的調(diào)脂藥[6-7]。同時(shí)，對(duì)于治療動(dòng)脈粥樣硬化和預(yù)防冠心病他汀類藥物也能發(fā)揮一定療效[6-7]。辛伐他汀(Simvastatin，Sim)為他汀類藥物，是臨床上治療高脂血癥的一線用藥。Sim作為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，在體內(nèi)主要抑制機(jī)體內(nèi)源性膽固醇的合成以及血液中膽固醇的含量[8]。但由于Sim水溶性較差，口服生物利用度有限，因此其臨床應(yīng)用受到一定限制[9]。脂質(zhì)聚合物納米粒(lipid-polymer hybrid nanoparticles, LPNs)，簡(jiǎn)稱納米粒，是近幾年研究較熱的一種新型納米給藥系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和納米粒給藥載體相比，其具有更優(yōu)良的生物相容性，較高的載藥量，生物可降解等優(yōu)勢(shì)，是一種極具發(fā)展前景和應(yīng)用前景的一種新型納米給藥載體[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建辛伐他汀納米粒，主要觀察其對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7周齡健康SD大鼠40只，清潔級(jí)，雄性，體重180～200 g，采購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(京)2016-0001]，本研究獲得大慶油田總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20191012)。大鼠以每籠3～4只飼養(yǎng)于排風(fēng)通氣籠具內(nèi)，自由飲水、攝食，飼養(yǎng)場(chǎng)所為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境中[SYXK(黑)2018-007]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，細(xì)胞以含20%胎牛血清、1%青-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑與儀器

辛伐他汀(貨號(hào)S6196)和COU-6(貨號(hào)442631)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總膽固醇(TC)試劑盒(批號(hào)20180105)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào)20180917)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào)20190106)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào)20181224)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德公司；AMPK抗體、p-AMPK抗體、Acetyl-CoA Carboxylase (ACC)抗體和p-ACC抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。高速剪切機(jī)(德國(guó)艾卡公司)；電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；JEOL JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本日本電子株式會(huì)社公司)；高壓均質(zhì)機(jī)(德國(guó)APV公司)；CX31倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；64R高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國(guó)馬爾文公司)； SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國(guó)美谷分子儀器公司)；AI600凝膠成像儀(美國(guó)通用電氣公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 辛伐他丁納米粒的構(gòu)建

制備辛伐他汀納米粒，將10 mg辛伐他汀和50 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶解在10 mL乙腈中作為有機(jī)相，磷脂25 mg溶解在0.5 mg無(wú)水乙醇中，然后加入到20 mL 60℃預(yù)熱的超純水中分散均勻作為水相。將油相在300 r/min攪拌條件下倒入到水相中，繼續(xù)室溫下攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈。經(jīng)0.8 μm的濾膜濾過(guò)，備用。取制備的辛伐他汀納米粒子，超純水稀釋50倍，取5 μL納米粒溶液滴加到銅網(wǎng)上，自然晾干，透射電鏡下觀察辛伐他汀納米粒的形態(tài)，同時(shí)利用納米顆粒分析儀測(cè)定其粒徑分布。

1.3.2 納米粒載藥系統(tǒng)細(xì)胞攝取研究

香豆素6(COU-6)作為有機(jī)熒光染料可模擬細(xì)胞對(duì)藥物的攝取行為。取對(duì)數(shù)期Caco-2細(xì)胞接種于兩個(gè)13 mm無(wú)菌玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過(guò)夜，次日取制備好的COU-6和COU-6納米粒(COU-6-LPNs)溶液各100 μL加入1.5 mL培養(yǎng)基中混勻備用，取出細(xì)胞，PBS洗2遍，各加入配備好的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5 h，后棄去細(xì)胞上層液體，用PBS輕柔洗細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，加入浸沒(méi)細(xì)胞量的DAPI 熒光染料(10 μg/mL)染色20 min，PBS洗3遍，封片，鋁箔紙避光4℃保存。熒光顯微鏡拍照，記錄熒光強(qiáng)度。

1.3.3 動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建、分組及給藥

構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，設(shè)立模型組(Model)、辛伐他汀組(Sim)、辛伐他汀納米粒組(Sim-LPNs)和對(duì)照組(Control)。Model組、Sim組和Sim-LPNs組大鼠腹腔注射60萬(wàn)IU/kg維生素D3，后以高脂飼料飼養(yǎng)8周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型；Control組腹腔注射等體積生理鹽水，以正常飼料飼養(yǎng)8周。造模完成后Control組和Model組每天灌胃給予生理鹽水，Sim組給予Sim 8 mg/(kg·d)， Sim-LPNs組給與Sim-LPNs 8 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥3周。

1.3.4 大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)

給藥最后1 d，動(dòng)物禁食過(guò)夜，各組大鼠以異氟烷持續(xù)麻醉，開(kāi)腹后于腹主動(dòng)脈取血約3 mL，室溫下靜置至凝固， 3000 r/min離心10 min，上清液即為血清，將血清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，參照TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 HE染色和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積統(tǒng)計(jì)

取血后迅速處死大鼠，并進(jìn)行解剖，取出肝樣本，將樣本左中葉剪下，置入10%甲醛溶液中固定。組織樣本在固定18 h后，流水沖洗12 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟浸泡，包埋，制成4 mm石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，最后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化并拍照。采用Photoshop(軟件)計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。

1.3.6 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝組織p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)變化

解剖各組大鼠，各取肝組織0.5 g左右，眼科剪剪碎后置于管中，加入1 mL細(xì)胞組織裂解液，均質(zhì)儀研碎并于冰上靜置5 min，參考文獻(xiàn)[1]方法提取蛋白，按每孔30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉。按需求加入AMPK抗體(1∶2000)、p-AMPK抗體(1∶500)、ACC抗體(1∶2000)、p-ACC抗體(1∶1000)或GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后加入相應(yīng)的抗兔IgG-HRP二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，PVDF膜以ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色并于AI600凝膠成像儀中成像，對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。磷酸化蛋白相對(duì)蛋白表達(dá)量= 磷酸化蛋白灰度值/(總蛋白灰度值/GAPDH灰度值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Sim-LPNs的體外表征

Sim-LPNs粒徑分布如圖1A所示， Sim-LPNs的平均動(dòng)力學(xué)直徑為(180±23) nm。如圖1B所示，在透射電鏡下，Sim-LPNs形態(tài)較為圓整，外觀呈均一的球形。

圖1 辛伐他汀納米粒徑分布和透射電鏡圖Figure 1 The size distribution and transmission electron micrograph of S-LPNs

2.2 納米粒載藥系統(tǒng)細(xì)胞攝取水平

COU-6為綠色熒光染料，如圖2所示，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，COU-6和COU-6-LPNs處理后的Caco-2細(xì)胞均可發(fā)出綠色熒光，但與COU-6相比，COU-6-LPNs呈現(xiàn)高熒光水平。結(jié)果如圖3所示， COU-6和COU-6-LPNs細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值分別為(221.3±34.5)和(756.8±78.4)，后者熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.01)。

2.3 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

檢測(cè)各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Control)相比，模型組(Model)大鼠TC、TG、LDL-C均顯著升高，HDL-C明顯降低(P<0.01)；相較于Model，辛伐他汀組(Sim)TG和HDL-C變化不明顯，TC和LDL-C顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與Model相比，辛伐他汀納米粒組(Sim-LPNs)TC、TG、LDL-C均顯著降低，HDL-C明顯升高(P<0.01)；與Sim相比，Sim-LPNs大鼠TC和LDL-C顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

2.4 各組大鼠主動(dòng)脈HE染色和粥樣硬化斑塊面積

如圖4所示，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠動(dòng)脈血管壁粘膜變性和水腫，在血管壁中出現(xiàn)典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，并且脂質(zhì)核心較厚，泡沫明顯；Sim組出現(xiàn)一定改善，但Sim-LPNs組改善更為明顯。計(jì)算各組斑塊面積，結(jié)果如表2所示，與Control組相比，Model組動(dòng)脈血管壁相對(duì)斑塊面積和相對(duì)斑塊面積/總面均顯著增加(P<0.01)；Control組和Sim組未見(jiàn)明顯差異；Sim-LPNs組相較于Model組動(dòng)脈血管壁相對(duì)斑塊面積和相對(duì)斑塊面積/總面明顯減小(P<0.01)。

2.5 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示，相較于Control組，Model組大鼠肝組織p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，Sim組p-AMPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Sim-LPNs組p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與Sim組相比，Sim-LPNs組p-AMPK蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯(P<0.01)，見(jiàn)表3和圖5。

注：A：Caco-2細(xì)對(duì)COU-6的攝取；B：Caco-2細(xì)對(duì)COU-6-LPNs的攝取。圖2 Caco-2細(xì)對(duì)COU-6和COU-6-LPNs的攝取Note. A, Caco-2 fine intake of COU-6. B, Caco-2 fine intake of COU-6-LPNs.Figure 2 Absorption capacity of Caco-2 to COU-6 and COU-6-LPNs

圖3 Caco-2細(xì)攝取COU-6和COU-6-LPNs后的 熒光強(qiáng)度Figure 3 Fluorescence intensity of Caco-2 after fine uptake of COU-6 and COU-6-LPNs

3 討論

LPNs作為近幾年大家比較關(guān)注的新型給藥系統(tǒng)，兼具傳統(tǒng)脂質(zhì)體和聚合物納米粒兩種納米藥物載體的優(yōu)點(diǎn)，在增加水不溶性藥物生物利用度和控制藥物釋放等方面顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11]。PLGA是一種生物可降解的材料、磷脂層為納米載體的外殼，對(duì)于疏水性藥物有更好的包載，而磷脂層外殼與細(xì)胞膜的表面具有類似的生理功能，因此可增加納米粒子的生物相容性，同時(shí)也能夠減緩藥物的釋放[12-14]。此外，納米粒子表面也可以進(jìn)行功能基團(tuán)的修飾，可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的攝取，增強(qiáng)藥效[15-16]。

本研究制備辛伐他汀納米粒，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其形態(tài)圓整，外觀呈均一的球形，更有利于增加對(duì)生物膜的穿透性及增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的藥效發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)LPNs可增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞對(duì)COU-6的攝取。研究顯示，Caco-2細(xì)胞可形成與小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和致密的單細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，分化出絨毛面A和基底面B，可做為研究藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的有效工具[17-18]。提示，LPNs能提高藥物的小腸吸收。觀察血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，Sim可顯著降低TC和 LDL-C水平；而Sim-LPNs不僅可更為顯著的降低TC和 LDL-C水平，還能顯著降低TG水平和升高HDL-C水平。提示，LPNs可

表1 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平Table 1 Serum TC, TG, LDL-C, HDL-C levels of rats in each group

圖4 各組主動(dòng)脈HE染色Figure 4 HE staining of aorta in each group

表2 各組大鼠動(dòng)脈血管壁相對(duì)斑塊面積

表3 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC相對(duì) 蛋白表達(dá)量Table 3 Relative protein expression of p-AMPK and p-ACC in liver tissues of rats in each group

圖5 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of p-AMPK and p-ACC protein in liver tissues of rats in each group

增強(qiáng)Sim的降脂效果。觀察各組大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化程度發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠動(dòng)脈血管壁粘膜變性和水腫，在血管壁中出現(xiàn)典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，并且脂質(zhì)核心較厚，泡沫明顯。Sim治療后病理變化得到一定改善，而Sim-LPNs治療后的改善效果更為明顯。計(jì)算各組粥樣硬化斑塊面積發(fā)現(xiàn)， Sim-LPNs治療后模型大鼠動(dòng)脈血管壁相對(duì)斑塊面積和相對(duì)斑塊面積/總面均明顯減小。這些提示，LPNs可顯著增強(qiáng)Sim對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果。

業(yè)已證明，AMPK-ACC信號(hào)通路在參與機(jī)體能量代謝和脂肪合成中發(fā)揮重要生理作用。文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK可通過(guò)直接磷酸化脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶類，從而改變脂質(zhì)的代謝方向。ACC是AMPK的下游靶點(diǎn)之一，由于ACC是脂肪酸代謝的限速酶，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，組織細(xì)胞內(nèi)AMPK被激活，而活化的AMPK可磷酸化ACC 的79 位點(diǎn)蘇氨酸位點(diǎn)而使后者失活[19-20]。ACC失活后，脂肪酸氧化加劇，血清游離脂肪酸水平降低，脂肪在組織中的沉積減少[19-21]。肝是人體重要的代謝器官，參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)的代謝。本研究觀察了肝AMPK和ACC蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠AMPK和ACC磷酸化蛋白均顯著下調(diào)，Sim治療后模型大鼠肝p-AMPK明顯上調(diào)，但ACC變化不明顯。而Sim-LPNs治療后模型大鼠肝p-AMPK和p-ACC均顯著上調(diào)。這些提示，相較于Sim，Sim-LPNs可明顯激活肝細(xì)胞AMPK-ACC信號(hào)通路，從而參與促進(jìn)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)。

綜上所述，相較于Sim，Sim-LPNs對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠具有較好的治療作用，而該作用可能與增強(qiáng)小腸對(duì)藥物的吸收和激活肝細(xì)胞AMPK-ACC信號(hào)通路增強(qiáng)脂質(zhì)代謝有關(guān)。