組織蛋白酶K影響老齡小鼠缺血性血管再生

葉華澤，董銳，曹慧敏，錢金晶，岳學(xué)玲，姜海英,*

(1嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林 延吉)

0 引言

機(jī)體受到缺血刺激時(shí)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可“歸巢”到缺血組織參與內(nèi)皮修復(fù)，然而老年人自體骨髓細(xì)胞的治療對(duì)血管再生的療效不佳[1,2]。組織蛋白酶K(cathepsin K，CatK)是體內(nèi)主要的彈性蛋白酶，參與缺血性血管再生過程。研究發(fā)現(xiàn)EPCs中CatK具有高表達(dá)[3-6]。本研究利用老齡小鼠下肢缺血模型，探討CatK對(duì)缺血性血管再生的作用機(jī)制，為尋找老年缺血性疾病細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

C57BL/6J小鼠(94-96周齡、25-35g)隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)、CatK抑制劑組(CatKⅡ組)，分別腹腔注射CatK抑制劑Ⅱ(CatKⅡ，5mg/kg/d) 或等量生理鹽水。

1.2 下肢缺血模型制備

小鼠麻醉剝離腹壁下動(dòng)脈并結(jié)扎，仔細(xì)分離單側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈和坐骨神經(jīng)，結(jié)扎并切除股動(dòng)脈，保留坐骨神經(jīng)。

1.3 測(cè)定血流恢復(fù)

利用激光多普勒血流儀，分別測(cè)定術(shù)前和術(shù)后第0，4，7，14天時(shí)雙下肢血流灌注情況。軟件分析同一時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)與非缺血側(cè)的血流并計(jì)算雙側(cè)血流比值。

1.4 缺血下肢毛細(xì)血管密度測(cè)定

利用免疫組化染色法CD31單克隆抗體(Santa Cruz 公司)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，測(cè)定毛細(xì)血管數(shù)量和密度。取5個(gè)肌肉橫切面視野，計(jì)算每個(gè)視野的毛細(xì)血管數(shù)量，取其平均值。以每高倍視野(×400)下毛細(xì)血管與肌纖維數(shù)的比值表示毛細(xì)血管密度。

1.5 蛋白表達(dá)

采用Western blot法檢測(cè)缺血骨骼肌Notch1、Cleaved Notch1、β-actin信號(hào)蛋白表達(dá)。抗體均購于cell signaling公司。

1.6 EPC測(cè)定

骨髓和外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞以表面標(biāo)記抗體(c-Kit+/CD31+)或同型對(duì)照標(biāo)記抗體標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)檢測(cè)陽性細(xì)胞數(shù)(抗體均購置于BD Pharmingen公司 )。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以Mean±SE表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制CatK減慢缺血下肢血流恢復(fù)

兩組均可觀察到下肢缺血術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，術(shù)后第7、14天CatKⅡ組缺血下肢血流恢復(fù)明顯弱于對(duì)照組(圖1A)，同樣觀察到缺血模型建立14天后CatKⅡ組缺血下肢CD31陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(圖1B)。提示抑制CatK明顯抑制老年小鼠缺血下肢的血流恢復(fù)。

2.2 CatK影響EPCs的動(dòng)員和歸巢

表1可見，骨髓EPCs數(shù)兩組之間無顯著性差異，而CatKⅡ組外周血EPCs數(shù)明顯少于對(duì)照組。提示抑制CatK明顯減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員-歸巢能力。

圖1 CatK抑制劑對(duì)缺血下肢血流恢復(fù)的影響

表1 骨髓和外周血CD31+ /c-Kit+陽性細(xì)胞百分比

2.3 EPCs的c-Notch1蛋白表達(dá)

CatKⅡ組c-Notch1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低；Notch1表達(dá)水平兩組之間未見差異(圖2)。

圖2 EPCs 的c-Notch1、Notch1信號(hào)蛋白表達(dá)

3 討論

隨著社會(huì)老齡化程度不斷加深，下肢動(dòng)脈硬化性疾病等缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升[7-9]。骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)的血管再生治療是目前行之有效的手段，但來自于老年人自體骨髓細(xì)胞的治療對(duì)心肌梗死等老年缺血性疾病的血管再生療效不理想[10-14]。

缺血、損傷等因素均可刺激骨髓中EPCs動(dòng)員-歸巢到受損組織，參與修復(fù)內(nèi)皮損傷及血管再生過程，需要多種蛋白酶的水解作用。Cheng[15-16]等利用不同年齡段小鼠下肢缺血模型提出衰老明顯抑制缺血下肢血流恢復(fù)，同時(shí)證實(shí)MMP-2、CatS參與缺血性血管再生過程。Van Hinsbergh等[17]提出缺血性血管再生過程可能有多個(gè)蛋白酶直接或間接參與的蛋白水解途徑作用。Urbich等報(bào)道EPCs中CatL和CatK具有高水平表達(dá)，但僅證實(shí)CatL在促使骨髓EPCs動(dòng)員-歸巢過程中發(fā)揮重要作用[18]。本研究利用CatK抑制劑觀察到CatK參與老齡小鼠缺血性血管再生過程，抑制CatK明顯減弱EPCs向缺血組織的動(dòng)員-歸巢能力，并且這可能與抑制EPCs的Notch1激活有關(guān)。

Notch信號(hào)通路是在進(jìn)化中高度保守的信號(hào)通路，在胚胎時(shí)期及出生后的血管再生中發(fā)揮著核心作用[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制CatK減少老齡小鼠EPCs的c-Notch1表達(dá)。Notch1發(fā)揮其生理作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于在γ-分泌酶等酶作用下的活化過程。新理論提出，包括CatK在內(nèi)的組織蛋白酶不僅在溶酶體內(nèi)起作用，也在細(xì)胞膜內(nèi)外顯示出蛋白酶活性[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)CatK具有類似γ-分泌酶的蛋白水解作用，激活Notch1，釋放出Notch1活性片段[21]。本研究認(rèn)為衰老可能改變CatK水平和/或活性，通過激活Notch1信號(hào)通路，降低EPCs的細(xì)胞生物學(xué)功能，從而影響缺血性血管再生過程。