基于整合藥理學研究麝香烏龍丸治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的分子機制

王志文，侯淋飛，張凱淇

(1.華北理工大學附屬醫(yī)院，河北 唐山；2.華北理工大學，河北 唐山)

0 引言

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以持續(xù)性滑膜炎、全身炎癥和自身免疫反應為主要特征的系統(tǒng)性疾病，中醫(yī)角度對疾病進行內(nèi)、外因分析認為，RA是由于正氣虧虛引起外邪侵襲，歸屬“痹證”的范疇。該疾病在婦女和老年人中最為典型，可引起軟骨、骨骼損傷和殘疾，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。對RA治療策略，首先是定期評估患者的疾病活動，并根據(jù)評估情況制定或修正治療方案。常用的抗風濕病藥物(anti-rheumatic drugs，DMARDs)包括生物和非生物型DMARDs，此外還有非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等，雖然大多數(shù)治療方案在臨床上證實具有顯著的療效，但許多人仍然對目前的治療沒有反應[2]。中醫(yī)學的整體調(diào)節(jié)、多環(huán)節(jié)、多渠道的效果，對該疾病的治療具有優(yōu)勢[3,4]，因此，深入研究疾病的發(fā)生機制和用藥靶點，挖掘有效的中成藥、藥物成分和核心化合物，將為RA的臨床診療提供新的思路。

王志文教授參閱了古書宋朝許叔微的《普濟本事方》中的記載，將“麝香圓”方劑應用于對RA的治療，確定了“麝香圓”方劑治療RA的藥物組成、劑量配比等指標，命名為麝香烏龍丸。近年來，針對麝香烏龍丸治療RA的機制，課題組進行了一些列實驗研究和臨床探索和考證。發(fā)現(xiàn)，麝香烏龍丸可通過調(diào)節(jié)炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素 -1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素 -6(interleukin-6，IL-6)或微小 RNA(microRNA)等，影響成骨細胞和破骨細胞的活性，進而緩解RA[3-8]。由于麝香烏龍丸成分多與作用方式復雜，因此本研究應用網(wǎng)絡藥理學的方法對RA的分子機制和麝香烏龍丸治療RA的分子機制進行系統(tǒng)和全面的挖掘，這將為RA的發(fā)病機制和治療靶點提供有價值的參考，也為深入研究麝香烏龍丸治療RA的作用提供更深層次、更多元的信息。

1 資料與方法

1.1 麝香烏龍丸活性化合物的篩選

大麝香烏龍丸的主要化合物為麝香、川烏、黑豆、全蝎、地龍，檢索化合物平臺如下：

(1)中藥系統(tǒng)藥理學[9](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，設置篩選參數(shù)：口服生物利用度(OB)≥30%；類藥性(DL)≥0.18，獲得化合物。

(2)中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)(http://119.3.41.228:8000/tcmid)獲得化合物。

共檢索到化合物59個，檢索到的化合物通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載sfd格式的化合物的2維結(jié)構(gòu)圖，并繪制韋恩圖。

1.2 麝香烏龍丸活性化合物靶點的收集

將保存的sfd格式的化合物的2D結(jié)構(gòu)圖導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測化合物作用靶點。

1.3 麝香烏龍丸化合物靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

將麝香烏龍丸的化合物靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件，以化合物和靶點為節(jié)點，兩者關(guān)系為邊，繪制化合物-靶點互作網(wǎng)絡。

1.4 AR疾病靶點的預測

選擇3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM 數(shù)據(jù)庫 (https://www.omim.org/)和DisGenet[10]數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/database/DB-0218)預測AR的靶點，輸入關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”進行檢索，靶點去重后，構(gòu)建AR的靶點庫，繪制疾病靶點韋恩圖。

1.5 麝香烏龍丸化合物靶點-AR疾病靶點互作網(wǎng)絡

疾病靶點和藥物靶點取交集后得到40個映射靶點，通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡。

1.6 點本體(gene ontology,GO)功能與KEGG通路富集分析

選擇DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進行GO功能與KEGG通路富集分析。校正篩選的藥物-疾病交集靶點名稱，輸入靶點和物種，以P＜0.05設定閾值進行檢索，對分析結(jié)果通過可視化網(wǎng)站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)導出結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 麝香烏龍丸化合物篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，查找麝香烏龍丸主要成分川烏、黑豆的活性化合物，篩選OB≥30%，DL≥0.18的化合物，結(jié)果顯示，川烏包含8種化合物，黑豆包含13種化合物。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索不到的成分麝香、地龍和全蝎采用TCMID數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果顯示麝香、地龍和全蝎分別包含25種、1種和11種化合物，將化合物通過PubChem數(shù)據(jù)庫查詢其2維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1，化合物成分的韋恩圖見圖1。

圖1 麝香烏龍丸成分化合物韋恩圖

2.2 麝香烏龍丸化合物靶點網(wǎng)絡

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示，除了地龍的一個化合物未找到靶點外，其他的四味中藥化合物的靶點經(jīng)過去重，共獲得231個靶點，其中麝香、川烏、黑豆和全蝎分別有93、59、65和71個靶點，并包含重復靶點，和特有靶點，如圖2。將中藥、化合物和靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得麝香烏龍丸化合物靶點網(wǎng)絡如圖3所示，該圖包含291個節(jié)點(中藥4個黃色三角形、56化合物六邊形、靶點231個菱形)，就389條邊。

圖2 麝香烏龍丸靶點韋恩圖

2.3 AR相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteininteraction,PPI)網(wǎng)絡

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和DisGenet數(shù)據(jù)庫共檢索到與RA相關(guān)靶點1119個，其中9個靶點為三個網(wǎng)站的交集靶點，分別為溶質(zhì)載體家族22(solute carrier family 22 member 4，SLC22A4)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)、肽基精氨酸二亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PADI4)、核因子抑制因子 1(Nuclear factor kappa b inhibitor like 1，NFKBIL1)、巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)白細胞介素 6(interleukin 6，IL6)、白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)、II類組織相容性復合物激活劑(class II major histocompatibility complex transactivator，CIITA) 和CD244分子(見圖4)。

2.4 麝香烏龍丸化合物靶點-AR疾病靶點互作網(wǎng)絡和分析

將231個化合物相關(guān)靶點與1119個疾病相關(guān)靶點取交集，得到40個化合物疾病共同靶點，通過對這40個靶點進行PPI網(wǎng)絡互作分析如圖4，將化合物靶點-RA疾病靶點經(jīng)生物過程(biologcalprocess，BP)分析顯示，前10位靶點主要參與轉(zhuǎn)錄起始、毒性反應應答、細胞凋亡、第二信使的調(diào)節(jié)，分子功能(molecular function，MF)分析顯示，靶點只要參與結(jié)合調(diào)節(jié)固醇類代謝、蛋白質(zhì)二聚化、酶結(jié)合活性、DNA結(jié)合活性、RNA聚合酶結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等調(diào)節(jié)，細胞組分(cellularcomponent，CC)分析發(fā)現(xiàn)，靶蛋白主要在線粒體膜外、細胞質(zhì)、細胞膜、核漿等部位分布。KEGG分析結(jié)果顯示，靶點主要為主要參與調(diào)控細胞凋亡、基因表達調(diào)控、細胞核受體-配體結(jié)合、內(nèi)分泌調(diào)控、cAMP信號、脂肪細胞脂肪分解的調(diào)節(jié)等相關(guān)通路(見圖5、圖6)。

3 討論

基礎和臨床研究證實，麝香烏龍丸方應用于臨床抗類風濕關(guān)節(jié)炎的治療具有良好的療效[3-8]。復方中，麝香為君藥，活血通絡，止痛消腫；川烏為臣藥，祛風散寒，除濕溫經(jīng)；全蝎、地龍為佐藥，鎮(zhèn)痙除痹，通絡止痛，共同祛寒濕之邪外出；黑豆為使藥，補肝益腎，健脾解毒。課題組針對麝香烏龍丸治療類風濕關(guān)節(jié)炎的機制進行了多層次的研究和探討，發(fā)現(xiàn)麝香烏龍丸可調(diào)節(jié)炎癥、滑膜微血管等[7,8]，最近又發(fā)現(xiàn)，其通過調(diào)節(jié)外周血微RNA，發(fā)揮抑制類風濕關(guān)節(jié)炎的作用[3,4]。由于中藥成分多，其作用靶點和通路復雜，因此本研究借助了生物信息學的手段和方法，分析了麝香烏龍丸治療類風濕關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點，以期進一步完善分子機制。本研究通過TCMSP、TCMID等化合物分析平臺篩選，得到了59個化合物；Swiss Target Prediction、GeneCard、OMIM、和 DisGenet等靶點預測平臺，結(jié)合生物信息分析平臺找到了40個麝香烏龍丸的化合物-RA疾病映射靶點，通過分析發(fā)現(xiàn)，麝香烏龍丸對凋亡的調(diào)控作用最為顯著，其次參與第二信使cAMP信號、和DNA及RNA的生物合成過程。

圖3 麝香烏龍丸靶點的PPI網(wǎng)絡

細胞因子、趨化因子和蛋白酶的產(chǎn)生，激活成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)，同時在RA滑膜區(qū)域，F(xiàn)LS細胞的死亡受體-線粒體凋亡途徑抑制，使FLS不受控制的生長，因此，F(xiàn)LS細胞凋亡不足被認為是RA的重要特征，在RA發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11,12]。在RA患者和膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen-induced arthritic rats)模型中研究證實，促進細胞凋亡是抑制RA的一種潛在的治療手段[13,14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，麝香烏龍丸全蝎中的有效成分可以抑制抗凋亡蛋白BCL-2，并與炎癥因子IL-6有關(guān)，另外，麝香中的有效成分參與對腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、cAMP和IL-10的調(diào)控，TNF-α是誘導FLS活化和RA的重要細胞因子，有研究報道，RA患者給予磷酸二酯酶抑制劑維持cAMP的水平，可減少促炎細胞因子TNF-α、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-17的產(chǎn)生，同時促進抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，因此，對cAMP的調(diào)控可通過調(diào)節(jié)免疫活性，抑制RA的發(fā)生[15,16]。值得注意的是，在麝香烏龍丸-RA映射靶點的KEGG 通路富集分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，大量富集靶點參與DNA的的表達調(diào)控，如影響DNA結(jié)合活性、RNA聚合酶結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等調(diào)節(jié)等。課題組前期已證實部分miRNA參與麝香烏龍丸抑制RA的調(diào)控，包括miRNA-181a、miRNA-16及miRNA-18a等[3]。它們可通過調(diào)節(jié)炎癥反應、免疫反應，影響關(guān)節(jié)和軟骨的重塑/損傷平衡，抑制RA。

圖4 麝香烏龍丸-RA映射靶點韋恩圖和PPI網(wǎng)絡

圖6 麝香烏龍丸-RA映射靶點KEGG通路富集分析

總之本研究的結(jié)果既驗證了課題組以往的研究，又補充和完善了麝香烏龍丸抗RA的新的靶點信息。然而，本研究僅通過生物信息學手段對麝香烏龍丸的抗RA機制進行初步預測，因此存在局限性，后續(xù)仍需要通過體內(nèi)外實驗充分驗證該預測信息，并通過循證醫(yī)學等分析方法進一步證實麝香烏龍丸在抗RA中的作用。