基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃芪-雞血藤配伍治療白細(xì)胞減少癥作用機制研究

林飛，黃丹，陳婷婷，楊晗，崔樹娜,,李士華

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001；2.揚州大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 揚州 225000)

白細(xì)胞減少癥是指外周血白細(xì)胞絕對計數(shù)持續(xù)低于4.0×109L-1，發(fā)病主要原因與白細(xì)胞生成減少、破壞或消耗過多、分布異常相關(guān)，西醫(yī)主要予病因治療，藥物治療(重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液、B族維生素、利血生以及免疫抑制劑等)，同時加強防治并發(fā)癥[1]。中醫(yī)學(xué)中無白細(xì)胞減少癥之病名，據(jù)其神疲體倦、面容憔悴、頭暈、脈虛無力等表現(xiàn)，歸屬祖國醫(yī)學(xué)中的“虛勞”范疇。虛勞的病因主要與臟腑氣血陰陽虧損、外感六淫等有關(guān)，以多個臟腑氣血陰陽虛損，久虛不復(fù)成勞為主要病機，尤以脾腎為主，研究表明白細(xì)胞減少與氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、血瘀質(zhì)、痰濕質(zhì)體質(zhì)關(guān)系相關(guān)，尤以氣虛最為密切[2]。因此，臨床常以補益為基本原則，采用益氣、養(yǎng)血、滋陰、溫陽等治療方法[3]。

我們對近年來中藥復(fù)方治療白細(xì)胞減少癥的文獻(xiàn)進(jìn)行發(fā)掘分析，發(fā)現(xiàn)使用頻次排名前5味中藥分別為黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、雞血藤、女貞子，而黃芪-雞血藤是排名第三名的高使用頻率藥對[4-5]。黃芪是常用補虛藥，具有補氣健脾、升陽舉陷、益氣固表、利水消腫、托毒生肌功效，雞血藤享有血分之圣藥，具有行血補血、調(diào)經(jīng)、舒筋活絡(luò)功效[6]，然黃芪-雞血藤藥對治療白細(xì)胞減少癥的作用機制報道較少。

因此，本文主要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪-雞血藤藥對治療白細(xì)胞減少癥的作用機制，并通過實驗文獻(xiàn)進(jìn)行驗證，闡明黃芪-雞血藤藥對治療白細(xì)胞減少癥的分子機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪、雞血藤化學(xué)成分篩選

本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)。藥物相似性和口服生物利用度是評價化合物活性的重要指標(biāo)，故以黃芪、雞血藤為關(guān)鍵詞搜索，以口服生物利用度(OB≥30%)，藥物相似性(DL≥0.18)為黃芪、雞血藤活性組分的篩選條件，從而確定有高度活性的關(guān)鍵化合物。

1.2 預(yù)測化合物的靶點

中藥靶點主要從以下兩種途徑獲取：①在Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中根據(jù)化合物名稱對其靶點進(jìn)行檢索，整理其靶點；②在CTD(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫中以化合物名稱檢索，篩選并整理其化合物對應(yīng)的靶點。兩個數(shù)據(jù)庫收集的化合物靶點進(jìn)行合并去重處理，建立中藥-成分-靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 白細(xì)胞減少癥靶點的收集

在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“Leukopenia”或“Aleukemia”為關(guān)鍵詞檢索白細(xì)胞減少癥的作用靶點，并將其導(dǎo)入EXCEL表格中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將黃芪、雞血藤的活性成分所對應(yīng)的靶點基因和白細(xì)胞減少癥相關(guān)的靶點基因進(jìn)行映射，獲得兩者的共同基因即為黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的作用靶點。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出來的基因輸入String11.0數(shù)據(jù)庫，將蛋白種類設(shè)置為人類(Homo sapiens)，“minimum required interaction score”參數(shù)設(shè)置為“highest confidence(0.900)”，其他參數(shù)保持初始默認(rèn)設(shè)置不變，導(dǎo)出蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)文件，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，對結(jié)果進(jìn)行可視化，從而建立蛋白與蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 Hub基因篩選

通過軟件Cytoscape插件CytoHubba中的MCC算法，計算并篩選排名前10的黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的hub基因。

1.7 GO富集和KEGG通路富集

將靶點基因輸入DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(http：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，研究黃芪-雞血藤藥對治療白細(xì)胞減少癥的生物功能以及信號通路，以P<0.05和FDR<0.05作為篩選條件，篩選具有顯著差異的生物過程和靶點通路。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-雞血藤化學(xué)成分篩選及獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索黃芪、雞血藤的活性成分，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件對活性成分進(jìn)行篩選，共發(fā)現(xiàn)活性成分35個，其中黃芪含有16個活性成分，雞血藤含有23個活性成分，兩者共有成分有4個。見表1。

2.2 黃芪、雞血藤-白細(xì)胞減少癥靶點及關(guān)鍵靶點獲取

在Genecards查詢白細(xì)胞減少癥的疾病靶點，共獲得208個靶點。在Genecards、CTD數(shù)據(jù)庫中檢索35個化合物主要活性成分，去除暫未發(fā)現(xiàn)靶點的13個化合物以及化合物靶點與疾病靶點并無交集的3個化合物，匯總19個化合物靶點并去重，共獲得4 729個藥物作用靶點。將4 729個藥物靶點與208個疾病靶點輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，篩選出TP53、FAS、FASLG、BIRC5、TOP1、EANE、IL-6、ABCB1、GPT、TNF、SOD1、CYP3A4、UGT1A1、XDH、PGR等108個共同靶點。

表1 黃芪、雞血藤活性成分及藥動學(xué)參數(shù)

2.3 黃芪、雞血藤活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將成分靶點以及疾病基因相映射，共得到108個靶點，將其共同靶點以及19個藥物化合物輸入Cytoscape3.6.1，構(gòu)建黃芪、雞血藤成分-白細(xì)胞減少疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及127個節(jié)點(19個活性成分和108個其所對應(yīng)的靶基因)和343個條邊，化合物條邊代表成分與靶點之間的相互關(guān)系，化合物條邊越多，作用的靶基因越多，說明其在治療白細(xì)胞減少癥的發(fā)揮著核心作用，根據(jù)化合物條邊結(jié)果顯示槲皮素(Quercetin)、Consume close grain、(+)-兒茶素[(+)-Catechin]、木犀草素(Luteolin)、山柰酚(Kaempferol)、刺芒柄花素(Formononetin)為黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的主要活性成分。見圖1。

2.4 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

108個共同靶點在STRING 11.0平臺分析的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI網(wǎng)絡(luò)模型)，設(shè)點大小與顏色反映自由度值(Degree value)大小，自由度越大代表生物功能越多，中心靶點自由度處于最高，說明在網(wǎng)絡(luò)圖中是關(guān)鍵的節(jié)點，周圍越低，PPI網(wǎng)絡(luò)圖中自由度值根據(jù)大小和顏色變化，依次是0～5,6～10,11～21。結(jié)果如圖2，PPI網(wǎng)絡(luò)包含60個基因靶點，其中0<自由度<5有36個，6<自由度<10有14個，11<自由度<21有10個。再對PPI網(wǎng)絡(luò)的每個節(jié)點進(jìn)行分析，篩選排名前24個基因靶點，顏色從淺入深代表重要程度遞增變化。綜合以上，自由度≥11的靶點包括PIK3CA、IL-6、B2M、TNF、VEGFA、IL-2、IL-10、KRAS、EGFR和ALB。

再通過Cytohubba插件MCC算法對靶點進(jìn)行分析，篩選前10個靶點，依次為PIK3CA、IL-6、TNF、IL-2、IL-10、KRAS、EGFR、CSF2、IL-3和IL-2RB，表明是黃芪-雞血藤藥對治療白細(xì)胞減少癥的關(guān)鍵靶點，其中，PIK3CA的自由度高于其他基因節(jié)點，說明此基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，具有橋梁和樞紐作用。見圖3。

2.5 GO功能富集分析

將108個預(yù)測靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。結(jié)果提示這些靶點涉及排名前20位的生物過程主要包括細(xì)胞壞死以及凋亡的調(diào)控，細(xì)胞的激活與增殖，造血、淋巴器官發(fā)生以及免疫系統(tǒng)的調(diào)控，有機物質(zhì)反應(yīng)以及磷酸化調(diào)節(jié)，見圖4。KEGG通路富集結(jié)果提示，這些靶點涉及了39條相關(guān)信號通路，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定與疾病密切相關(guān)的信號通路，涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，藥物代謝，造血細(xì)胞系，JAK-STAT信號通路等，見圖5。

3 討論

黃芪作為常用補虛藥，具有調(diào)控機體免疫和代謝功能、改善造血和心血管功能、促進(jìn)血管神經(jīng)修復(fù)、抑制腫瘤和細(xì)胞凋亡、抗菌和抗病毒、抗纖維化的作用[7-13]。雞血藤享有血分之圣藥，具有調(diào)節(jié)免疫、改善造血功能、抗血栓、調(diào)節(jié)脂代謝、抑菌、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤、護(hù)肝等功效[14-17]。白細(xì)胞減少癥作為血液系統(tǒng)疾病，病因復(fù)雜，與腫瘤化療、藥物、免疫、感染等相關(guān)。目前有關(guān)黃芪、雞血藤中藥臨床研究很多，常用中藥制劑包括參附、參麥、生脈等注射液以及芪膠升白、地榆升白膠囊，中西藥聯(lián)合治療能顯著刺激骨髓造血功能，改善免疫抑制且毒副反應(yīng)較低[18-20]。不過因中藥化學(xué)成分復(fù)雜，很難獲知其在體內(nèi)作用的整體作用網(wǎng)絡(luò)，所以黃芪-雞血藤升白細(xì)胞的有效成分、機制尚未完全闡明，故本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)研究黃芪-雞血藤升白細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點、通路及分子機制。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪、雞血藤中共19種活性成分及108個潛在靶點，參與細(xì)胞壞死和凋亡的調(diào)控，細(xì)胞激活與增殖，造血功能以及免疫系統(tǒng)的調(diào)控等主要生物過程。主要作用的信號通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、藥物代謝，造血細(xì)胞譜，JAK-STAT信號通路等。造血源于造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞既可以自我更新，也可以分級分化為定向祖細(xì)胞，其潛能降低，最終將產(chǎn)生所有成熟的血細(xì)胞。而細(xì)胞因子及其受體相關(guān)的JAK是祖細(xì)胞在不同成熟步驟所必需的，因此調(diào)節(jié)細(xì)胞因子與細(xì)胞受體相互作用及JAK-STAT信號在血細(xì)胞發(fā)生過程中具有重要意義[21-22]。Janus激酶家族是一小類識別受體相關(guān)信號分子，是對來源于Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞因子受體重要的級聯(lián)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學(xué)過程，主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT組成。近年來，靶向酪氨酸激酶的小分子藥物成為多種疾病的研究熱點。研究表明，JAK2通過直接參與血小板生成素(TPO)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和參與干細(xì)胞因子下游的信號傳導(dǎo)，在造血干細(xì)胞的功能和維持中發(fā)揮作用[23]。因此，調(diào)控JAK-STAT通路具有重要作用，也充分證實了通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥靶點和作用通路具有可行性和研究價值。

黃芪、雞血藤中槲皮素(Quercetin)、Consume close grain、(+)-兒茶素[(+)-Catechin]、木犀草素(Luteolin)、山柰酚(Kaempferol)、刺芒柄花素(Formononetin)等主要成分能通過直接或間接作用于PIK3CA、IL-6、TNF-α、IL-2、IL-10、KRAS、EGFR、CSF2、IL-3，激活機體內(nèi)造血功能，提升白細(xì)胞數(shù)量。研究表明槲皮素能夠顯著改善環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4、CD8以及兩者比值，具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫抑制、提升機體免疫力作用[24-26]。雞血藤醇提物和兒茶素具有抗氧化、抗腫瘤以及促造血雙重調(diào)控作用，保護(hù)骨髓造血干/祖細(xì)胞，減少其凋亡，激活造血因子相關(guān)JAK-STAT信號通路，促進(jìn)造血，改善造血微環(huán)境[27-28]。兒茶素調(diào)節(jié)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞增殖及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平，改善機體免疫細(xì)胞失衡，提高正常及環(huán)磷酰胺致免疫低下型小鼠的細(xì)胞免疫以及體液免疫[29-30]。木犀草素具有消炎、抗過敏、抗癌、提高免疫應(yīng)答等作用，研究發(fā)現(xiàn)其可通過TLR4/NF-κB信號通路抑制TNF-α、IL-6的分泌，改善哮喘患者免疫調(diào)節(jié)功能[31-32]。山柰酚具有抗腫瘤功效和免疫調(diào)節(jié)作用[33-34]。

PIK3CA作為黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的關(guān)鍵靶點，是PI3K的催化亞基，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，突變后可增強激酶活性，提高細(xì)胞增殖、黏附、遷移等相關(guān)生物學(xué)特性，PIK3CA在一些腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等)的發(fā)生發(fā)展、診療以及預(yù)后具有重要價值，靶向調(diào)控PIK3CA也是近年來治療腫瘤系統(tǒng)疾病的熱點[35-40]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，闡釋黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的分子網(wǎng)絡(luò)機制，為開展進(jìn)一步藥理作用研究提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)單個活性成分能作用于多個靶點，多個活性成分也可作用于單一靶點，且通過多條通路發(fā)揮復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，共同起到治療白細(xì)胞減少癥的作用，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分-多靶點-多通路調(diào)控的特征，為中藥治療白細(xì)胞減少癥的作用機制提供了新思路。同時，在研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪-雞血藤不僅能治療白細(xì)胞減少癥，對于腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵分子PIK3CA也具有調(diào)控作用，推測其可能用于抗腫瘤研究，也拓展了其新的藥理作用。然而，本研究只是在分子機制上的預(yù)測，黃芪-雞血藤治療白細(xì)胞減少癥的具體作用機制仍需通過進(jìn)一步實驗以及臨床研究予以驗證。