26種中藥注射劑對單胺氧化酶體外抑制作用研究 *

劉子修，周燕萍，許多，劉梅，楊波，劉靜，司梁宏，陸瑜

(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥學部，江蘇 南京 210002)

近年來，中藥在治療人類疾病中發(fā)揮著越來越重要的作用。在臨床使用中湯劑由于服用、攜帶、貯存等問題易導致患者依從性較差，現(xiàn)代化的中藥劑型在臨床治療中應用更為廣泛，發(fā)揮了重要作用。然而中藥制劑的多組方、多成分、多靶點等復雜性以及對其認知的有限性，導致現(xiàn)在中藥制劑尤其是中藥注射劑因安全性遭誤解。但根據(jù)國家藥監(jiān)局發(fā)布的2019年度國家藥品不良反應監(jiān)測年度報告，中藥不良反應連續(xù)4年下降，另外，在所有注射劑不良反應報告中，化學藥品注射劑占86.9%，中藥注射劑占9.1%，生物制品占1.6%。中藥制劑由于它的復雜性和未知性，需要我們必須對其進行不斷探索。

本研究來源于臨床用藥案例，某抑郁患者使用單胺氧化酶(MAO)抑制劑嗎氯貝胺的同時，長期使用某中藥注射劑，后患者死亡，我們根據(jù)患者用藥基本情況，考慮其藥物相互作用的可能性。為了更好地研究藥物相互作用，本研究擬建立一種靈敏性強、可靠度高、選擇性好、干擾性低的方法，篩選臨床常用中藥制劑對MAO的潛在影響，為臨床應用避免藥物相互作用產(chǎn)生不良反應，指導臨床合理用藥，并為這些MAO抑制劑的深入研究提供依據(jù)，為其新的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.2 儀器

大型超凈工作臺(德國Exco公司)，AllegraX-30R高速低溫冷凍離心機(美國Beckman公司)，0.1～1 mL多功能移液槍(德國Biohit公司)，F(xiàn)SH-2A型可調(diào)高速勻漿機(金壇市岸頭華天科教儀器廠)，LG100B理化干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)，AR2140電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，微型漩渦混合器(美國Silentshake公司)，KQ5000E型超聲波清洗器(昆山超聲波清洗機有限儀器公司)，多功能酶標儀(美國Biorad公司)，Waters Acquity UPLC-TQS型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)，Trace1310-TSQ8000氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 藥品與試劑

丹參川芎嗪注射液(批號：20180328)，心脈隆注射液(批號：1806101)，熱毒寧注射液(批號：180629)，舒血寧注射液(批號：A04171108)，燈盞花素葡萄糖注射液(批號：20161103)，參芪扶正注射液(批號：170936)，腎康注射液(批號：201712011)，益氣復脈注射液(批號：20160921)，大株紅景天注射液(批號：1001171103)，喜炎平注射液(批號：2018012003)，注射用血栓通(批號：18050716)，骨瓜提取物注射液(批號：1706011)，復方苦參注射液(批號：20161119)，紅花黃色素氯化鈉注射液(批號：61301110)，燈盞細辛注射液(批號：20170333)，血必凈注射液(批號：1712281)，艾迪注射液(批號：20171126)，參麥注射液(批號：1708111)，丹紅注射液(批號：18042024)，脈絡寧注射液(批號：20180311)，天麻素注射液(批號：04671004)，醒腦靜注射液(批號：180719)，丹參多酚鹽酸注射液(批號：17111622)，康萊特注射液(批號：1711266-1)，谷紅注射液(批號：20171210)，生脈注射液(批號：17071211)。

標準品5-羥吲哚乙酸(5-HIAA，批號：1-JST-155-1)，購自加拿大Toronto Research Chemicals公司，苯甲醛(批號：STBH5776)，購自美國SIGMA Aldrich公司。內(nèi)標5-HIAA-d5，批號：12-SBK-2-1，購自加拿大Toronto Research Chemicals公司，苯甲醛-d6，批號：ZZS19100908，購自中國上海甄準生物科技有限公司。檢測所用到的有機試劑均為色譜純試劑。實驗用水均為Milli-Q超純水(Millipore，Bradford，美國)。其他試劑均為分析純試劑。

1.4 MAO的制備

參考張萬萍的方法并加以改進[1]，選取體質(zhì)量約300 g的SD雄性大鼠，斷髓致死，于紫外滅菌的超凈臺中迅速取出肝臟，用0.9%的生理鹽水洗滌3次，拭干，取肝組織5 g，置于0.3 mol/L蔗糖溶液175 mL中勻漿，將肝勻漿置于高速低溫(4 ℃)冷凍離心機中，以1 500 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液，以10 000 r/min離心30 min，棄去上清，取沉淀混懸于0.3 mol/L蔗糖溶液4 mL中，再加入1.2 mol/L蔗糖溶液40 mL中，以10 500 r/min離心40 min，棄去上清液，所得沉淀為MAO粗酶原。再用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.6)洗滌1次，加入100 mmol/L磷酸鉀緩沖液40 mL使沉淀混懸，分裝進15 mL離心管中，于-80 ℃儲存，備用。

1.5 MAO介導的檢測產(chǎn)物的獲取

1.5.1 MAO-A抑制藥物體外反應條件的選擇 使用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)配制反應液，其中26種中藥制劑的反應濃度均參照臨床靜脈注射給藥配制，司來吉蘭10 nmol/L[2]。取140 μL反應液和MAO酶原40 μL，于37 ℃孵育15 min后，加入底物5-HT(20 mmol/L，20 μL)，37 ℃反應15 min，隨即加入10%高氯酸50 μL，終止反應，再加乙酸丁酯1 mL，渦旋2 min，提取產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)于10 000×g離心5 min，取上清液-80 ℃保存，待測。

1.5.2 MAO-B抑制藥物體外反應條件的選擇 使用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.6)配制反應液，其中26種中藥制劑的反應濃度均參照臨床靜脈注射給藥配制，氯吉蘭10 nmol/L[3]。取156 μL反應液和MAO酶原40 μL，于37 ℃孵育15 min后，加入底物芐胺(50 mmol/L，4 μL)，37 ℃反應15 min，隨即立即加入10%高氯酸50 μL，終止反應，再加環(huán)己烷1 mL，渦旋2 min，提取產(chǎn)物苯甲醛。于10 000×g離心5 min，取上清液-80 ℃保存，待測[2]。

1.6 色譜-質(zhì)譜檢測

1.6.1 5-HIAA檢測

1.6.1.1 標準溶液制備 準確稱取5-HIAA溶解于甲醇，均配置為1 mg/mL標準品儲備母液，保存于-20 ℃冰箱，存放時間不超過6個月。準確稱取5-HIAA-d5溶解于甲醇，配置0.5 mg/mL內(nèi)標儲備母液，保存于-20 ℃冰箱，存放時間不超過6個月。精確量取15 μL 5-HIAA儲備母液入10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液至10 mL，配置成為儲備液(5-HIAA濃度1 500 ng/mL)。轉(zhuǎn)移至15 mL棕色玻璃瓶中保存。

5-HIAA的標準曲線設置7個濃度點，標準曲線樣品采用梯度稀釋法配制，5-HIAA的濃度設置為10、25、50、100、250、500、750 ng/mL。同時進行空白樣品(不加內(nèi)標)、零點樣品(加內(nèi)標)制備和檢測?？瞻缀土泓c樣品用于判斷是否有內(nèi)源性干擾，不參與計算。以待測物濃度為橫坐標，待測物與相應內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行線性回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線。

1.6.1.2 樣品制備 準確移取100 μL標準曲線樣品/樣本/質(zhì)控樣品，氮氣吹干，然后用100 μL含200 ng/mL內(nèi)標的乙腈溶液復溶，渦旋混合1 min，離心5 min(14 000 r/min)，再用200 ng/mL內(nèi)標的乙腈溶液稀釋上清10 000倍，取100 μL溶液進行LC-MS/MS分析用于檢測5-HIAA。

1.6.1.3 5-HIAA含量檢測 5-HIAA檢測根據(jù)Jiang[4]的方法并加以改進，通過Waters Acquity UPLC-TQS型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Waters)進行檢測。色譜柱為Waters BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)。

色譜條件和參數(shù)：流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈。流動相梯度變化如表1所示。流速為0.40 mL/min，進樣量為1.0 μL，柱溫為40 ℃。

表1 流動相梯度

質(zhì)譜條件和參數(shù)：離子源為電噴霧化學電離源(ESI)，正離子模式檢測，離子源溫度為600 ℃，掃描方式為MRM，掃描時間為200 ms，脫溶劑氣流速為1 000 L/h，進樣錐氣體流速為150 L/h，霧化器壓力為0.7 MPa。5-HIAA定量離子對m/z為192.090 2/118.344 6和192.090 2/146.085 9，碰撞電壓分別為28 V和16 V，5-HIAA-d5定量離子對m/z為197.159 6/122.287 4和197.159 6/150.240 2，碰撞電源分別為26 V和16 V。樣品檢測中均勻插入質(zhì)控(QC)樣品的檢測，用于監(jiān)督儀器的穩(wěn)定性和目標化合物的穩(wěn)定性。

1.6.2 苯甲醛檢測

1.6.2.1 標準溶液制備 準確稱取苯甲醛標準品溶于正己烷，配置1 mg/mL標準品儲備母液，保存于-20 ℃冰箱，存放時間不超過6個月。準確稱取苯甲醛同位素標準品溶于正己烷，配置成1 mg/mL內(nèi)標儲備母液，保存于-20 ℃冰箱，存放時間不超過6個月。

苯甲醛標準曲線共設置10個濃度點，標準曲線樣品采用梯度稀釋法配置，苯甲醛標準品的濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10、15、20、30、50 μg/mL，同時進行空白樣品(不加內(nèi)標)、零點樣品(加內(nèi)標)分析。空白和零點樣品用于判斷是否有內(nèi)源性干擾，不參與計算。標準曲線樣品內(nèi)標終濃度為25 μg/mL。以苯甲醛濃度為橫坐標，苯甲醛與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行線性回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線。

1.6.2.2 樣品制備 使用含有25 μg/mL的正己烷溶液稀釋樣品200～1 000倍，用于苯甲醛的GC-MS/MS檢測。同樣方法制備QC樣品。

1.6.2.3 苯甲醛含量檢測 苯甲醛檢測方法根據(jù)Zhao等[5]的方法并加以改進，通過Trace1310氣相色譜儀(Thermo Fisher Scientific，美國)和TSQ8000質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific，美國)聯(lián)用系統(tǒng)進行檢測。色譜柱為TR-35MS(0.25 μm，30 m×0.25 mm)毛細管色譜柱，氦氣(99.999%純度)為載氣，氬氣(99.999 9%純度)為碰撞誘導的解離氣體。

色譜條件和參數(shù)：柱溫箱起始溫度為50 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min升溫到90 ℃，之后以20 ℃/min升溫到110 ℃，之后再以30 ℃/min升溫到260 ℃，保持4 min。進樣口溫度為250 ℃，流速為1.0 mL/min，流量控制模式為線速度，進樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件和參數(shù)：電子電離源(EI)，70 eV，正離子模式檢測，掃描方式為MRM。離子源溫度為240 ℃，傳導線溫度為270 ℃。苯甲醛定量用離子對m/z為106.1/77.1，碰撞電壓為12 V；內(nèi)標定量用離子對m/z為110.1/82.1，碰撞電壓為12 V。樣品檢測中均勻插入質(zhì)控(QC)樣品的檢測，用于監(jiān)督儀器的穩(wěn)定性和目標化合物的穩(wěn)定性。

1.7 中藥注射劑對MAO抑制效果的判別

通過比較26種中藥注射劑處理和陽性對照藥物處理產(chǎn)生的反應終產(chǎn)物5-HIAA和苯甲醛的含量，研究中藥制劑對MAO-A和MAO-B的抑制效果。

2 結(jié)果

2.1 26種中藥注射劑對MAO-A的抑制效果

本研究獲得的5-HIAA標準曲線為Y=0.007 456 66X+0.003 910 99(R2=0.999 513)，通過內(nèi)標法求得不同組別樣本中5-HIAA的濃度。結(jié)果表明，與陽性對照藥物氯吉蘭處理后生成5-HIAA量相比，其余26種中藥制劑處理后5-HIAA生成量均顯著升高，因而這26種中藥制劑對MAO-A的抑制均無明顯作用。26種中藥制劑樣品名稱、處理后5-HIAA生成量、制劑成分和療效詳見表2。5-HIAA通過LC-MS/MS檢測的空白組、對照組及樣品組(脈絡寧注射液)色譜圖見圖1。

表2 不同藥物對5-HIAA濃度的影響

2.2 26種中藥注射劑對MAO-B的抑制效果

本研究獲得的苯甲醛標準曲線為Y=0.047 47X-0.005 283(R2=0.999 9)，通過內(nèi)標法求得不同組別樣本中苯甲醛的濃度。結(jié)果表明，與陽性對照藥物司來吉蘭相比，有24種中藥制劑能夠引起苯甲醛含量的降低，即對MAO-B的抑制有明顯的提升，詳見表3。其中康萊特注射液對MAO-B的抑制效果最高。苯甲醛通過GC-MS檢測的空白組、對照組及樣品組(脈絡寧注射液)色譜圖見圖2。

表3 不同藥物對苯甲醛濃度的影響

3 討論

MAO作為一種黃素蛋白酶，存在于許多組織的細胞線粒體外膜上，尤以肝、腎、腦組織的含量較為豐富，具有催化單胺的氧化脫氨作用，是生物體內(nèi)自行產(chǎn)生的氧化生物胺的酶[6-7]。MAO結(jié)構(gòu)由一個黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶以共價鍵連接到活性中心區(qū)域的半胱氨酸殘基組成，按照底物的選擇性和對抑制劑的靈敏度來區(qū)分，MAO通常被分為2種亞型，即對5-HT、腎上腺素、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和抑制劑氯吉蘭、嗎氯貝胺具有高親和性的MAO-A和對苯乙基胺(PEA)、芐胺、苯甲胺以及它的不可逆抑制劑司來吉蘭具有高親和性的MAO-B[8]。它們在大腦和肝臟等周圍神經(jīng)組織中催化生物體產(chǎn)生胺類物質(zhì)(DA、5-HT、NE、色胺等)，并通過氧化脫氨產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)，對維持機體正常的生理功能具有重要意義[9]。研究表明，MAO在神經(jīng)組織中過多，會產(chǎn)生過量的胺代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物被認為是引發(fā)各類精神疾病的重要原因。以上這些特性決定MAO抑制劑在臨床的重要性，其中MAO-A抑制劑主要用于治療抑郁癥和焦慮癥，通過抑制MAO-A，減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降解，而相對提高中樞單胺類遞質(zhì)水平，提高患者的情緒，發(fā)揮抗抑郁作用[10]；而MAO-B抑制劑則主要用于治療帕金森病和阿爾茨海默病，其機制是單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)能抑制腦內(nèi)MAO的活性，減少DA的降解，相對升高該部位DA水平，恢復其與膽堿能神經(jīng)間的平衡，從而緩解病理反應[11]。

然而傳統(tǒng)的MAOIs在治療中，容易引起低血壓的現(xiàn)象，并且具有較大的肝腎毒性，因此研發(fā)篩選高選擇性、可逆、低毒副作用的MAOIs是當前的研究熱點[12]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)芳香胺類MAOIs中的嗎氯貝胺在抗抑郁治療中的不良反應小，并且耐受性良好，患者能夠長期足量用藥[13]。由于人腦中MAO的活性隨著年齡增大而升高，而腦中兒茶酚胺類物質(zhì)隨著年齡增大而減少，因此嘗試采用MAOIs進行抗神經(jīng)退行性疾病的研究，通過篩選找出對腦內(nèi)MAO選擇性強的芳香胺類MAOIs司來吉蘭，在臨床上治療早期帕金森病中取得了滿意的效果[14]。另一種芳香胺類MAOIs帕吉林具有顯著的降血壓作用，并且無明顯毒副作用，故而在臨床上多用于原發(fā)性高血壓患者的治療[15]。隨著研究的深入又發(fā)現(xiàn)MAOIs的一些新用途如：有報道稱應用MAOIs治療可以減輕早期急性腦缺血的神經(jīng)元損害和卒中癥狀[16]。

由于MAO的水平與機體的抑郁和衰老存在著密切的關聯(lián)，因此人們一直積極尋找效率高，副作用小的MAOIs。針對中藥材的藥理學研究已經(jīng)證實部分中藥及其復方制劑能夠顯著影響機體的MAO水平，如：朱建偉等[17]的研究結(jié)果表明川芎、丹參以及川丹合劑均能顯著降低大鼠腦組織中MAO水平，盡管川芎與丹參合用后其下調(diào)作用略有回升。李滿生等[18]通過研究壽聰膠囊對AD大鼠行為學及腦組織中MAO的影響發(fā)現(xiàn)，其能通過降低大鼠腦組織內(nèi)MAO的含量實現(xiàn)其對AD模型大鼠的預防和治療。張權生等[19]的研究結(jié)果證實了黃精水提液能夠顯著降低老年大鼠大腦內(nèi)MAO水平，提高其腦內(nèi)NE的水平。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MAO-A的活性與年齡無關，而MAO-B的活性隨年齡的增加而加強,與年齡呈正相關，被認為是老化的標志，可間接反映生物體的老化程度[20]。在此基礎上，通過對中醫(yī)藥文獻中抗衰老藥方的研究，證實了鹿茸、人參、冬蟲夏草、何首烏、黃芪、當歸、川芎、麥冬、五味子等中藥材具有良好的MAO-B抑制作用[21-26]。而MAO-A的作用更多是與抑郁相關，因此MAO-A抑制劑在臨床上作為抗抑郁藥物的一種有著廣泛的運用。在中藥領域內(nèi)，疏肝類中藥復方是治療抑郁癥的主要方劑[27]，已有的研究已經(jīng)證實了如柴胡疏肝散、小柴胡湯、越鞠丸、逍遙散、開心散、柴胡加龍骨牡蠣湯等均能顯著增加大腦海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，故而推斷MAO-A是該類型中藥復方的作用靶點之一[28-30]。

依賴于GC-MS技術，我們檢測了體外MAO抑制實驗中不同藥物對反應終溶液中苯甲醛濃度的影響，從而證實了除大株紅景天注射液、艾迪注射液以外的其余24種中藥制劑均有顯著的MAO-B抑制作用。而UPLC-MS的結(jié)果顯示26種中藥制劑對MAO-A在體外的抑制作用并不顯著。通過對以上中藥制劑主治功能的分析，我們發(fā)現(xiàn)以上藥物大多具備活血、益氣等功效，臨床上常用于心腦血管疾病等衰老性疾病的治療。從組分的角度分析以上中藥制劑，我們構(gòu)建的體外MAO抑制模型證實了含紅參、麥冬、五味子、丹參、川芎、黃芪、當歸等中藥制劑對MAO-B的抑制效果，同時對MAO-A體外無明顯的抑制效果也與此前文獻報道相一致。因此從以上角度均能證明本次研究所選模型的有效性和研究結(jié)果的可靠性。

由于本次研究并未涉對藥物量效關系的探討，故而在中藥制劑濃度的選擇上參照了其靜脈滴注時所使用的濃度，而司來吉蘭在本次模型中的起始濃度則參考了其細胞實驗中所使用的濃度，因此我們的結(jié)果并不能證明多種中藥制劑對MAO-B的抑制效價優(yōu)于陽性藥，但這些中藥制劑對MAO-B的體外抑制作用是顯著的。此外，在本次研究還發(fā)現(xiàn)臨床上通常用于腫瘤患者輔助治療的康萊特注射液在26種中藥制劑中抑制MAO-B的效果最好，而目前對于其主要組分薏苡仁油的藥理學研究主要集中在抗腫瘤的藥物活性上，而其他中藥制劑的藥理學研究主要以防治高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥為主，并且本次研究還首次證實了紅花總黃酮和燈盞花總黃酮對MAO-B的體外抑制作用?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果將為康萊特注射液等制劑對MAO的影響提供參考，同時為以上中藥制劑治療帕金森病和阿爾茨海默病的細胞和動物實驗提供依據(jù)。