溫運(yùn)顆粒對(duì)嬰幼兒脾虛瀉糞便短鏈脂肪酸的代謝調(diào)控 *

徐珊,林麗麗,汪受傳,

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

腹瀉是嬰幼兒常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一，脾虛證是其常見(jiàn)證型[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療多以腸黏膜保護(hù)劑[2]、微生態(tài)制劑[3]、糾正脫水及其他對(duì)癥治療為主。溫運(yùn)顆粒為全國(guó)名中醫(yī)汪受傳教授基于50年臨床實(shí)踐總結(jié)的兒童脾虛瀉中醫(yī)臨床驗(yàn)方，療效確切[4]。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，是對(duì)代謝產(chǎn)物變化及其揭示生物體生命活動(dòng)代謝性質(zhì)的系統(tǒng)科學(xué)研究。糞便中代謝產(chǎn)物主要包括人體內(nèi)源性代謝物、腸道菌群代謝物及其他化合物[5]。

本研究采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)技術(shù)，以糞便樣本為例，分析了嬰幼兒脾虛瀉經(jīng)溫運(yùn)顆粒干預(yù)前后糞便短鏈脂肪酸(SCFAs)的代謝變化，為進(jìn)一步探討溫運(yùn)顆粒治療嬰幼兒脾虛瀉可能的干預(yù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

腹瀉病例來(lái)源于2015年1月至2017年6月期間南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名醫(yī)堂，符合兒童腹瀉疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且符合脾虛瀉證候診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，共30例。其中男孩21人，女孩9人。對(duì)照組來(lái)自健康體檢兒童30例，其中男孩19人，女孩11人。2組納入年齡均為出生后3個(gè)月至3歲。臨床資料見(jiàn)表1。2組在月齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、喂養(yǎng)方式方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。2組在采樣當(dāng)日糞便次數(shù)、糞便顏色、糞便性狀方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，腹瀉組符合遷延性腹瀉患兒糞便的特征。伴有不同程度脫水等嚴(yán)重合并癥者；有明確先天/后天遺傳代謝障礙疾病者；合并心血管、肝腎系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等其他原發(fā)疾病的患兒均不符合納入標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2014NL-090-02)，所有患兒在納入研究前，均由其監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書(shū)。

表1 2組一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 設(shè)備與試劑 Trace 1310氣相色譜、AS1310自動(dòng)進(jìn)樣器、TSQ 8000質(zhì)譜儀、TG-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、Speed Vac離心濃縮儀均購(gòu)置于美國(guó)Thermo公司；Allegra 64R離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))；CPA225D電子天平(Sartorius，德國(guó))；Synergy型超純水系統(tǒng)(Millpore，美國(guó))；BGZ-140型真空干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；Allegra 64R型渦旋振蕩器(Scientific Industries，美國(guó))。

氫氧化鈉(西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：160705)；1-丙醇(北京百靈威有限公司，批號(hào)：LR30O43)；氯甲酸正丙酯(北京百靈威有限公司，批號(hào)：NCBKO-AF)；己酸、吡啶(99%，Sigma，美國(guó))；正己烷(97%，Sigma，美國(guó))。

對(duì)照品：異丁酸(99%)、異戊酸(99%)、戊酸(98%)均購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社；庚酸(98%)、丁酸(99%)均購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙酸(98.3%，Dr.Ehrenstorfer，德國(guó))；乙酸(99%，Sigma，美國(guó))。

1.2.2 分組與給藥 選取年齡3個(gè)月至3歲兒童，分為2組，其中30例脾虛瀉患兒為腹瀉組，30例健康兒作為對(duì)照組。

腹瀉組給予溫運(yùn)顆粒口服。療程為1周。溫運(yùn)顆粒(由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的配方顆粒)組成為蒼術(shù)6 g，煨益智仁6 g，砂仁1.5 g，炮姜3 g，茯苓6 g，炒麥芽12 g。服用方法：3個(gè)月～2歲，每劑均分6份，每次服1份，一日3次；2歲～3歲，每劑均分3份，每次服1份，一日3次。

1.2.3 樣本采集 采集納入研究的患兒治療前后的糞便各2 g，對(duì)照組健康兒童糞便2 g，于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.2.4 檢測(cè)糞便SCFAs樣本前處理 稱取50 mg糞便，加入1 000 μL 0.005 mol/L的NaOH水溶液(含5 μg內(nèi)標(biāo)己酸-d3)，渦旋10 min后，4 ℃離心(15 000 r/min)20 min，取500 μL上清加入10 mL玻璃離心管中，再加入300 μL純水，渦旋30 s，混勻[8]。

向上述提取液加入500 μL丙醇吡啶溶液(3∶2，v/v)和100 μL氯甲酸正丙酯。渦旋10 s，超聲1 min。衍生化后，使用正己烷萃取衍生化物質(zhì)，首先向反應(yīng)體系加入300 μL正己烷，渦旋1 min后，3 000 r/min離心5 min。取200 μL上層正己烷萃取液于進(jìn)樣瓶中。再次向反應(yīng)體系中加入200 μL正己烷，渦旋1 min后，3 000 r/min離心5 min。再次取200 μL上層正己烷萃取液于進(jìn)樣瓶中。2次萃取液混合并離心后，取上清60 μL用于GC-MS/MS分析[8-9]。

1.2.5 檢測(cè)糞便SCFAs色譜和質(zhì)譜分析條件 載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，采用分流模式，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，分流比為10∶1，升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min速率升至70 ℃后，然后以3 ℃/min速率升至85 ℃，再以5 ℃/min速率升至110 ℃后，然后以30 ℃/min速率升至290 ℃后保持8 min；進(jìn)樣量為1 μL。采用EI源，離子源溫度為230 ℃，離子傳輸線溫度為290 ℃，電離能為70 eV，m/z采集范圍為30～600[8,10]。

2 結(jié)果

2.1 總離子流圖

對(duì)照組，腹瀉組治療前、后3組糞便樣本隨機(jī)選擇各1例?？傠x子流圖如圖1。從圖中可見(jiàn)，各組在色譜峰數(shù)量、種類及峰高均存在一定差異，推測(cè)3組糞便中的SCFAs存在一定差異。

2.2 SCFAs檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)提取SCFAs及內(nèi)標(biāo)的峰面積檢測(cè)各組中SCFAs的水平，結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，腹瀉組治療前糞便中的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸水平顯著降低(P<0.05)；與治療前比較，脾虛瀉兒童治療后糞便中的丁酸、異丁酸、異戊酸水平顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

3 討論

SCFAs是由1～6個(gè)碳原子組成的有機(jī)脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸等[11]，是腸道細(xì)菌發(fā)酵未消化碳水化合物的主要產(chǎn)物，也是蛋白質(zhì)降解和氨基酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物，是腸道菌群代謝產(chǎn)物中最主要的標(biāo)志物之一[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)菌群失調(diào)動(dòng)物模型中SCFAs顯著減少[15]。SCFAs的代謝活動(dòng)，可能是腸道細(xì)菌與宿主間相互作用最重要的體現(xiàn)，乙酸、丙酸、丁酸是腸道SCFAs的主要組成部分，三者約占SCFAs總量的90%～95%[16]。其中丁酸是腸道所有發(fā)酵產(chǎn)物中最重要的一種，是結(jié)腸、盲腸上皮細(xì)胞最重要的能量來(lái)源[17-18]。

目前關(guān)于SCFAs的功能有以下方面：①SCFAs可促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)，維持腸黏膜形態(tài)。刁慧[19]研究表明，在豬回腸末端灌注不同濃度的SCFAs，腸道pH下降，有效抑制了腸上皮細(xì)胞凋亡。②SCFAs可通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體[20-21]以及抑制組蛋白去乙?；竅22-23]，發(fā)揮腸道免疫調(diào)節(jié)功能[24-25]。比如乙酸鹽和丙酸鹽通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Treg，而丁酸鹽通過(guò)GPCRs激活途徑活化結(jié)腸內(nèi)免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。③研究還發(fā)現(xiàn)SCFAs有維持水電解質(zhì)平衡、抗病原微生物、改善腸道功能等重要作用[26-27]。

SCFAs測(cè)定結(jié)果顯示，脾虛瀉患兒糞便中的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的水平較對(duì)照組明顯降低，提示脾虛瀉存在腸道菌群失調(diào)、腸道功能紊亂、腸道黏膜免疫失衡等情況。與正常兒相比，溫運(yùn)顆粒能顯著提高脾虛瀉患兒腸道內(nèi)丁酸、異丁酸、異戊酸水平。據(jù)此推測(cè)溫運(yùn)顆粒發(fā)揮溫陽(yáng)運(yùn)脾止瀉功效的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和腸道免疫，改善腸道內(nèi)環(huán)境有關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。此結(jié)果與課題組同期開(kāi)展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致[8]。