大黃蟲丸治療JAK2-V617F陽性真性紅細(xì)胞增多癥的臨床研究

鄧來軍，董楊，王翠，孫偉國，展昭民，孫長崗

(1.濰坊市中醫(yī)院血液科，山東 濰坊 261000;2.濰坊市中醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東 濰坊 261000；3.哈爾濱血液腫瘤研究所血液科，黑龍江 哈爾濱 150000)

真性紅細(xì)胞增多癥(PV)相對于其他骨髓增殖性腫瘤患者，伴有更高的JAK2-V617F陽性率(達到95%)，目前該突變已被納入WHO最新的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，針對該突變的JAK2抑制劑蘆可替尼已經(jīng)在國內(nèi)上市，但是只對一部分患者有效，原因尚不明確，而且價格昂貴。中醫(yī)對該病有較完整的認(rèn)識，屬于“血積(髓癥)”[2]范疇，病位在髓，病機為血瘀，治則為活血化瘀，但尚無統(tǒng)一的治療方法。本課題組應(yīng)用大黃蟲丸治療PV，取得了滿意的療效，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年12月濰坊市中醫(yī)院收治的JAK2-V617F陽性PV血瘀證住院患者43例，隨機(使用SPSS軟件)分成對照組21例、治療組22例，臨床基線資料見表1，2組比較均具有可比性(P>0.05)。收集10例免疫性血小板減少癥(ITP)患者作為空白組，性別、年齡與以上2組相符，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(2017-倫理審查-14)。

表1 2組患者基線資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2008年WHO關(guān)于PV的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。主要標(biāo)準(zhǔn)：①男性血紅蛋白(HGB)>185 g/L，女性HGB>165 g/L，或其他紅細(xì)胞容積增高的證據(jù)——HGB或HCT大于按年齡、性別和居住地海拔高度測定方法特異參考范圍百分度的第99位，或如果血紅蛋白比在無缺鐵情況下的基礎(chǔ)值肯定且持續(xù)增高至少20 g/L的前提下男性HGB>170 g/L，女性HGB>150 g/L;②有JAK2-V617F突變或其他功能相似的突變(如JAK2第12外顯子突變)。次要標(biāo)準(zhǔn)：①骨髓活檢：按患者年齡來說為高度增生，以紅系、粒系和巨核細(xì)胞增生為主;②血清紅細(xì)胞生成素(EPO)水平低于正常參考值水平;③骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)有內(nèi)源性紅系集落形成。符合2條主要標(biāo)準(zhǔn)和1條次要標(biāo)準(zhǔn)或第1條主要標(biāo)準(zhǔn)和2條次要標(biāo)準(zhǔn)則可診斷PV。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[4]。①舌質(zhì)紫黯或舌體瘀斑、瘀點, 舌下靜脈曲張瘀血。②面部、唇、齒齦及眼周紫黑者。③肌膚甲錯 (皮膚粗糙、肥厚、鱗屑增多)，不同部位的靜脈曲張，毛細(xì)血管擴張。④固定性疼痛或刺痛、絞痛。⑤出血后引起的瘀血、黑糞、皮下瘀斑，或空腔臟器的積血和積液。⑥月經(jīng)紊亂、痛經(jīng)、色黑有塊。⑦肢體麻木或偏癱。⑧精神、神志異常。⑨脈澀或結(jié)代，或無脈。⑩腹部抵抗感或壓痛等腹診陽性者。臟器腫大、新生物、炎性或非炎性包塊、組織增生。影像學(xué)顯示血管狹窄、閉塞或血流阻滯；抑或血小板聚集性或血液流變學(xué)等理化指標(biāo)異常提示循環(huán)瘀滯。凡具有上述依據(jù)2項及以上者, 可以診斷為血瘀證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合真性紅細(xì)胞增多癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，JAK2-V617F陽性，且中醫(yī)辨證為血瘀證。②患者簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①對試驗藥物過敏。②合并嚴(yán)重?zé)o法控制的感染。③肝、腎等主要器官功能不全。④伴有精神疾病。⑤已經(jīng)參與其他臨床試驗者。

2 方法

2.1 治療方法

對照組：羥基脲(齊魯制藥有限公司，0.5 g/片)起始劑量30 mg/(kg·d)，口服，1周后改為5～20 mg/(kg·d)維持，維持外周血紅細(xì)胞數(shù)在(3.5～4.0)×1012/L。療程為3個月。

所有患者紅細(xì)胞壓積>50%時行紅細(xì)胞單采術(shù)，常規(guī)阿司匹林抗凝，如有感染，予抗感染，存在活動性出血，予止血藥物或輸注血小板，出現(xiàn)血栓、栓塞等并發(fā)癥，予抗凝、溶栓等。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 臨床療效及不良反應(yīng)觀察 入選患者治療前后進行癥狀積分評定(采用MPN-SAF-TSS評估量表)[5]，采用統(tǒng)一表格記錄患者主要癥狀和體征，包括疲勞、早飽感、腹部不適、活動力不佳、注意力不集中、夜間盜汗、皮膚瘙癢、骨痛、發(fā)熱、體質(zhì)量減輕等10組癥狀，每組0～10分，0代表無，10代表最嚴(yán)重。2組治療前后均行血常規(guī)、肝腎功能、上腹部彩超、骨髓細(xì)胞形態(tài)及活檢檢測以評定臨床療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無效(NR)、疾病進展(PD)，嚴(yán)格參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]。治療后記錄藥品不良反應(yīng)，按國際腫瘤化療藥物不良反應(yīng)評價系統(tǒng)——通用不良反應(yīng)術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)4.0版[7]。2組治療前后應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測PV患者JAK2-V617F突變率，采集患者新鮮骨髓液4 mL以100 U/mL的肝素抗凝。應(yīng)用DNA提取試劑盒提取標(biāo)本的基因組DNA。DNA終濃度為50～100 ng/μL，-20 ℃保存。分子學(xué)緩解(PMR)定義為JAK2-V617F突變負(fù)荷較前減少≥50%。DNA提取試劑盒由北京博邁德生化科技有限公司提供，檢測儀器為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)7500型實時熒光定量PCR儀。具體嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。

2.2.2 血瘀證證候積分評估 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(2002版)》[8]，分級量化表共有13組癥狀，去除未見及月經(jīng)癥狀，共有9組，分別為刺痛、脈絡(luò)瘀血、皮下瘀斑、癥積、舌質(zhì)紫暗、舌體瘀斑、瘀點、澀脈或無脈、肌膚甲錯、肢體麻木或偏癱、善忘，擬定：無癥狀=0分，輕癥=1分，中癥=2分，重癥=3分。

2.2.3 骨髓威廉姆斯腫瘤基因(WT1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、微血管密度(MVD)水平測定 2組患者骨髓活檢組織在治療前(43例患者隨機選取21例，其中對照組10例，治療組11例)采集，2組治療后全部采集，空白組在治療前采集?；顧z組織切片采用免疫組化法檢測VEGF、COX-2、WT1表達水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。鼠抗人VEGF單克隆抗體及免疫組化試劑盒購自福州邁新生物制品公司；COX-2抗人單克隆抗體購自Santa Cruz; WT1免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司；CD105單克隆抗體購自中杉金橋公司。均使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。判定標(biāo)準(zhǔn)：WT1免疫組化位于細(xì)胞核，VEGF、COX-2免疫組化位于細(xì)胞質(zhì)。出現(xiàn)棕色染色顆粒為陽性，選取3個高倍鏡視野區(qū)域(×400)，記錄陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)的比例，依次按<1%=0分，1%～10%=1分，11%～50%=2分，>50%=3分記錄分值，染色強度計分按無=0分、淡黃色=1分、棕黃色=2分、棕褐色=3分計分，記錄以上2種計分方法，取總和，3分(包括3分)以上為+，以下為-。MVD測定：CD105單克隆抗體標(biāo)記MVD[9-10]，切片于光鏡下(×100)選定3個微血管密集區(qū)，在高倍鏡(×400)視野區(qū)域計數(shù)微血管數(shù)，取均值。檢測儀器為奧林巴斯CX 31顯微鏡。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 2組患者治療前后MPN-SAF-TSS評估積分比較

結(jié)果見表2。

表2 2組患者治療前后MPN-SAF-TSS評估積分比較

3.2 2組患者治療前后血瘀證證候積分比較

結(jié)果見表3。

表3 2組患者治療前后血瘀證證候積分比較

3.3 2組患者臨床療效比較

結(jié)果見表4。治療組總有效率(CR+PR)高于對照組(P<0.05)。達到分子學(xué)緩解(PMR)例數(shù)，治療組明顯高于對照組(P<0.01)。

表4 2組患者臨床療效比較

3.4 2組患者不良反應(yīng)比較

結(jié)果見表5。2組患者治療中均未見到3級以上藥品不良反應(yīng)；1～2級不良反應(yīng)2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 2組患者不良反應(yīng)比較

3.5 2組患者WT1、VEGF、COX-2、MVD水平的比較

結(jié)果見圖1。2組治療前WT1、VEGF、COX-2、MVD表達水平均高于空白組(P<0.01)，治療組治療后WT1、VEGF、COX-2、MVD表達水平均有顯著下降(P<0.01)，其中WT1、VEGF、COX-2下降水平優(yōu)于對照組(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，WT1與VEGF顯著相關(guān)(r=0.513，P<0.01)，WT1與COX-2顯著相關(guān)(r=0.316，P<0.01)。

4 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，真性紅細(xì)胞增多癥(PV)是由于稟賦不足，感受內(nèi)外毒邪，形成血瘀，屬“血證”范疇[2]。早期多以實證為主，伴隨疾病進展而見虛實夾雜。觀察發(fā)現(xiàn)，大黃蟲丸應(yīng)用于PV，能夠取得很好的療效。該方出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》:“五勞虛極羸瘦，腹?jié)M不能飲食……內(nèi)有干血，肌膚甲錯……緩中補虛,大黃蟲丸主之。”[11]條文所治之證其表現(xiàn)和病機均與骨髓增殖性腫瘤相類似。大黃蟲丸中土鱉蟲攻下積血為主藥；熟大黃攻下、涼血、清熱和土鱉蟲共為君藥。桃仁、干漆、水蛭、蠐螬、虻蟲輔助君藥以活血通絡(luò)，攻逐瘀血，為臣藥。杏仁配桃仁滋潤燥結(jié)，且能破血降氣，利于祛除瘀血；佐以黃芩，和大黃共清瘀血之熱；加用地黃、芍藥養(yǎng)血滋陰，亦為佐藥。甘草和中補虛，調(diào)和諸藥，緩和破血藥峻猛傷正，為使藥。諸藥合用共奏祛瘀涼血、滋陰潤燥之功。

PV進展緩慢，生存期可從幾年到幾十年不等，延長患者生存期，改善生活質(zhì)量為治療的主要目的[12]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，大黃蟲丸能夠明顯改善患者的疲勞、體質(zhì)量下降、腹部不適、注意力不集中、皮膚瘙癢、骨痛等癥狀。血栓栓塞為PV常見不良事件，本研究入組的PV患者中，血栓事件發(fā)生率達到41.9%，與國內(nèi)多項研究類似[13-14]，血栓事件仍是PV患者的主要危險因素。依據(jù)血瘀證證候積分，大黃蟲丸能夠改善患者脈絡(luò)瘀血、癥積、舌質(zhì)、脈證等癥狀，減少血栓事件的發(fā)生。羥基脲為治療PV常用的藥物，價格低廉，服用方便，但是其分子學(xué)緩解率較低[15]。本項研究證實單用羥基脲的PV患者分子學(xué)緩解率僅有14.3%，加用大黃蟲丸可使其提高至45.5%，并能夠提高患者臨床有效率(CR+PR)。綜上分析，大黃蟲丸可改善患者的臨床常見癥狀，并可能通過降低JAK2-V617F突變負(fù)荷，獲取深層次的臨床緩解率，而且未見嚴(yán)重不良反應(yīng)，安全性較好。

WT1基因參與造血調(diào)控，與細(xì)胞的克隆性增殖關(guān)系密切，過表達提示疾病預(yù)后不良，最近Cottin等[16]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性血小板增多癥(ET)或PV骨髓纖維化轉(zhuǎn)化過程中WT1轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。腫瘤的生長依賴新生血管的形成，VEGF是血管生成的中樞性調(diào)節(jié)因子，在骨髓增殖性腫瘤中過度表達，參與血管新生[17-18]。COX-2為一種誘導(dǎo)型酶，在惡性血液病中高表達，刺激惡性造血細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡[19]。VEGF與COX-2在多個通路中存在聯(lián)系，協(xié)同促進誘導(dǎo)腫瘤血管新生作用[20]，而WT1可通過多種途徑調(diào)控VEGF表達，被認(rèn)為是血管新生的啟動因素[21-22]。同樣，在骨髓增殖性疾病患者中MVD也明顯高于健康人群，以上說明VEGF、COX-2、MVD表達越高，血管新生越明顯。因ITP患者不存在JAK2-V617F基因突變，骨髓病理組織中WT1、VEGF、COX-2及MVD的水平與正常人相同[9-10,16]，為進一步明確PV患者與腫瘤血管新生的相關(guān)性，本研究選用ITP患者作為空白組。本研究表明PV患者的WT1、VEGF、COX-2、MVD表達均較空白組明顯升高，經(jīng)治療后下降，治療組WT1、VEGF、COX-2下降明顯，并證實WT1與VEGF、COX-2的關(guān)聯(lián)。綜上分析PV患者加用大黃蟲丸對血管新生具有抑制作用，機理可能是下調(diào)上游的WT1基因，抑制相關(guān)調(diào)控因子如VEGF、COX-2的表達。