白樺BpbZIP1 基因抗旱耐鹽分析及ABRE 元件結(jié)合鑒定

郭依萍，石晶靜，周美琪，于 穎，王 超

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

持續(xù)惡化的自然環(huán)境使得植被不斷受到各種各樣的非生物脅迫導(dǎo)致生物量不斷減少。對(duì)基因工程研究的不斷深入，使科研人員對(duì)植物在抗性方面的研究取得了顯著成就。與植物抗逆相關(guān)的基因主要包括可以編碼滲透壓物質(zhì)的基因、抗氧化基因、編碼保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的基因、編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因以及編碼可在逆境中誘導(dǎo)的植物蛋白激酶基因[1]。

堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（bZIP）普遍存在于真核生物當(dāng)中，參與多種生物學(xué)功能，如植物的生長(zhǎng)[2]、損傷修復(fù)[3]、逆境脅迫的抵御[4-9]以及病菌的防御[4-5]。

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域含有大約60 到80 個(gè)氨基酸殘基，由一個(gè)16 至20 個(gè)保守氨基酸殘基組成的堿性氨基酸區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈共同組成[10]。保守的堿性氨基酸區(qū)含有核定位的信號(hào)序列，緊隨其后的是DNA 的識(shí)別區(qū)域， 該區(qū)域可以與特異的DNA 序列相互作用。亮氨酸拉鏈區(qū)是一個(gè)具有兩親性的α 螺旋[11]，α 螺旋中，每個(gè)重復(fù)的七肽都包含一個(gè)亮氨酸或者其他的疏水殘基。該螺旋結(jié)構(gòu)參與bZIP 蛋白與DNA 結(jié)合之前的二聚體化[12]。植物的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子主要存在于細(xì)胞核中[13]。

干旱和高鹽等條件下，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以與ABFs 和AREBs 結(jié)合，從而調(diào)控下游的靶基因，ABFs 是元件ABRE 的結(jié)合因子，AREBs 是元件ABRE 的結(jié)合蛋白，其核心序列為ACGT。擬南芥的抗逆相關(guān)基因ICK1、rd29B、rab18、KIN2/KAT2、ADH1、CHS、racS、SUS1 的啟動(dòng)子區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了ABRE 順式作用元件[14]。Choi 等第一次克隆了擬南芥中的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，主要包括參與低溫應(yīng)答反應(yīng)的ABF1、參與高鹽、干旱等逆境應(yīng)答反應(yīng)的ABF2/AREB1、ABF3以及ABF4/AREB2[15]。大豆中鑒定了10 個(gè)亞家族共131 個(gè)bZIP基因，其中，有近三成bZIP基因可以響應(yīng)高鹽干旱等逆境脅迫[16]。Liao 等選取其中的4 個(gè)GmbZIP基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)其均能對(duì)逆境脅迫產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答[17]。Xiang 等鑒定出了水稻中的bZIP基因OsbZIP23，該基因可以顯著提高水稻中的耐旱、耐鹽性[18]。Kranner 等將bZIP 家族中的ThbZIP1基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，可以提高煙草的部分保護(hù)酶（超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD））的活性，以此減少活性氧的數(shù)量來有效的克服逆境環(huán)境[19]。

白樺（Betula platyphyllaSuk）作為東北地區(qū)重要的綠化及用材樹種，鑒定重要抗旱耐鹽基因，研究分子調(diào)控機(jī)制，具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。本研究克隆白樺bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，驗(yàn)證抗旱耐鹽功能，為研究白樺抗非生物脅迫性狀形成的的分子基礎(chǔ)研究及抗性分子育種提供理論數(shù)據(jù)和研究材料。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白樺組培苗培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)室，溫度為25℃，光周期為12 h 光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度 400 μmol·m－2·s－1。白樺的野生型無菌幼苗作為RNA 提取和過表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化材料。pROKⅡ載體和大腸桿菌（Escherichia coli）Top10、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 RNA 提取試劑盒（Takara，大連）用于提取白樺的總RNA；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，大連）合成cDNA 第一鏈。通過白樺基因組分析及擬南芥抗性bZIP基因同源比對(duì)， 確定白樺bZIP基因序列。 利用pROKⅡ質(zhì)粒的和白樺BpbZIP1基因序列設(shè)計(jì)引物，其中，pROKⅡ載體SmaⅠ同源序列用下劃線表示出來，如下：bZIP-pROKⅡF′，5′-CTCTAGAGG ATCCCGACAGACCCACCGGGCGATG-3′和bZIP-pROKⅡR′，5′-＞TCGAGCTCGGTACCCCAACGCT AACACCTCCAGCT-3 ′（ 金 唯 智 ， 江 蘇 ） 。 以cDNA 為模板擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：正向引物與反向引物各1 μL、模板2 μL、dNTP 4 μL（2.5 mmol·L－1，Takara， 大連）、TransTaqTaq DNA Polymerase High Fidelity（ 2.5 U·μL－1） 0.5 μL、 Buffer 5 μL、去離子水36.5 μL，為50 μL 體系。PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸90 s、共35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用膠回收試劑盒（Takara，大連）回收，將回收產(chǎn)物連接到pROKⅡ載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10，通過篩選送至金唯智測(cè)序公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。

1.2.2 植物工程菌株的制備 采用液氮法將BpbZIP1-pROKⅡ質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，通過陽(yáng)性篩選后保存于－80℃的冰箱中備用。

1.2.3BpbZIP1基因生物信息學(xué)分析 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)從擬南芥bZIP 每個(gè)亞家族中共選取46 個(gè)擬南芥bZIP 蛋白[20]，從NCBI 網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找6 個(gè)檉柳bZIP 蛋白，根據(jù)BpbZIP1 蛋白序列信息用MEGA5.0 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。用BioEdit 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.2.4BpbZIP1基因GFP 融合表達(dá)載體亞細(xì)胞定位 利用基因槍介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將融合表達(dá)載體BpbZIP1-PBI121-GFP 轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.2.5BpbZIP1基因?qū)Π讟宓乃矔r(shí)轉(zhuǎn)化及表達(dá)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因方法參照發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行[21-22]。為檢測(cè)基因是否在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化株系中表達(dá)，根據(jù)BpbZIP1基因序列信息設(shè)計(jì)定量引物，正向引物5′-TC CATGAACATGGACGAGCT-3′，反向引物5′-ATG CTGCCGCTGCGGCAAGC-3 ′ ， 選 擇 β-tubulin和ubiquitin（ GenBank Ac. Num.: HO112154 and FG065618）作為內(nèi)參基因。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析[23]，反應(yīng)體系如下：上下游引物各 1 μL、模板2 μL、去離子水7 μL 和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL（Toyobo Co.，Osaka，Japan）總體系為20 μL，3 次重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性12 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s、78.4℃讀板1 s，共45 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成該反應(yīng)。讀數(shù)分析其數(shù)據(jù)，運(yùn)用2－ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析[24]。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS17.0（SPSS Inc,Chicago,IL,USA）。利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較處理組和對(duì)照組的差異顯著性。

1.2.6BpbZIP1耐鹽抗旱功能分析

1.2.6.1 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺的組織化學(xué)染色 以瞬時(shí)轉(zhuǎn)化過表達(dá)載體的植株為實(shí)驗(yàn)組，以瞬時(shí)轉(zhuǎn)化空載體的植株為對(duì)照組，分別用水、200 mmol·L－1NaCl 溶液和200 mmol·L－1甘露醇溶液處理，培養(yǎng)48 h 后，剪取大小一致的葉片用于化學(xué)染色，利用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、伊文思藍(lán)（Evans blue）和氮藍(lán)四唑（NBT）染色，檢測(cè)其活性氧積累及細(xì)胞損傷程度。將剩下的植株液氮研磨用于其他生理指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.6.2 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺的生理指標(biāo)分析 將液氮研磨后的樣品用植物組織銅鋅-超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（建成生物工程研究所，南京）測(cè)定轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系SOD 活性。利用過氧化物酶（POD）測(cè)試盒（建成生物工程研究所，南京）測(cè)定轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系POD 酶活。

1.2.7 結(jié)合元件分析 根據(jù)已發(fā)表數(shù)據(jù)選取ABRE順式作用元件（ACGTGGC）作為主要研究對(duì)象，利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)[25-26]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與ABRE元件及6 個(gè)突變?cè)慕Y(jié)合驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpbZIP1 基因的克隆

通過白樺基因組數(shù)據(jù)分析及擬南芥抗性相關(guān)bZIP基因同源比對(duì)分析，鑒定了一條白樺bZIP基因，該基因完整的開放讀碼框（ORF）共有1 269個(gè)堿基，總共編碼422 個(gè)氨基酸殘基，將其命名為BpbZIP1。以野生型白樺cDNA 為模板，使用特異性的基因引物bZIP-pROKⅡF’和bZIP-pROKⅡR’，利用RT-PCR 對(duì)其進(jìn)行克隆，擴(kuò)增出含載體同源序列的大小的目的片段（圖1）。目的片段連接到pROKⅡ載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，選取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與序列一致，說明成功克隆獲得BpbZIP基因。

2.2 BpbZIP1 基因的生物信息學(xué)分析

將BpbZIP1 蛋白序列與擬南芥和檉柳中多條蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖2）表明：BpbZIP1蛋白與擬南芥AtbZIP12、AtbZIP67、AtbZIP14 和AtbZIP27 進(jìn)化關(guān)系較近，其中，與BpbZIP1 蛋白親緣關(guān)系最近的AtbZIP12 蛋白在非生物脅迫中起到重要作用[27]，推測(cè)出BpbZIP1 蛋白也可能具有抗逆作用。

將BpbZIP1 蛋白與進(jìn)化樹中進(jìn)化關(guān)系較近的AtbZIP12、AtbZIP14 和AtbZIP27[20]進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果（圖3）表明：比對(duì)得出很多相似的保守區(qū)，用紅色框標(biāo)出，其中，含有堿性亮氨酸拉鏈域的用藍(lán)色框標(biāo)出。

圖1 BpbZIP1-pROKⅡ載體菌液PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig. 1 PCR verification of BpbZIP1-pROKⅡ vector

2.3 氯化鈉和甘露醇脅迫下BpbZIP1 基因的表達(dá)

為檢測(cè)BpbZIP1基因是否對(duì)鹽和旱脅迫應(yīng)答，通過實(shí)時(shí)定量分析了白樺野生型中BpbZIP1基因在受到甘露醇和NaCl 脅迫不同時(shí)間梯度后的表達(dá)模式，結(jié)果（圖4）表明：在NaCl 脅迫時(shí)，BpbZIP1基因在6、12 、24 h 時(shí)白樺體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低，在脅迫48 h 時(shí)高度誘導(dǎo)表達(dá)；在甘露醇脅迫時(shí)，表達(dá)變化不明顯。說明BpbZIP1基因響應(yīng)NaCl 脅迫，干旱脅迫響應(yīng)較弱。

2.4 亞細(xì)胞定位

用pBI121-GFP 質(zhì)粒做為對(duì)照組，轟擊洋蔥表皮細(xì)胞后進(jìn)行暗培養(yǎng)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后洋蔥表皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明：對(duì)照在細(xì)胞膜以及細(xì)胞核內(nèi)均含有綠色熒光，BpbZIP1-PBI121-GFP 只有在洋蔥表皮細(xì)胞核中有綠色熒光的出現(xiàn)，與DAPI 核染色位置一致，說明BpbZIP1轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。

2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因白樺株系的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，能夠快速篩選鑒定基因功能。本研究將BpbZIP1-pROKⅡ表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因效率，結(jié)果（圖6）顯示：在轉(zhuǎn)基因白樺中，BpbZIP1基因的表達(dá)量明顯高于野生型對(duì)照白樺植株，驗(yàn)證檢測(cè)出的過表達(dá)的陽(yáng)性株系用于之后的非生物脅迫相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.6 BpbZIP1 轉(zhuǎn)基因白樺抗旱耐鹽性分析

圖2 BpbZIP1 與其他物種bZIP 蛋白進(jìn)化分析Fig. 2 Evolution analysis of BpbZIP1 and other bZIP proteins

2.6.1 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺的組織化學(xué)染色結(jié)果 在對(duì)白樺野生型進(jìn)行BpbZIP1基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化之后，以轉(zhuǎn)化pRKOⅡ空載體的白樺為參照，根據(jù)著色程度可以鑒別白樺細(xì)胞的損傷情況及活性氧積累，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明：在沒有進(jìn)行非生物脅迫（對(duì)照組）時(shí)，BpbZIP1 轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照（WT）基本著色淺且相互之間無明顯差異，說明細(xì)胞損傷程度基本相同。在NaCl 和甘露醇脅迫下，白樺的著色不同程度的加深，BpbZIP1 基因的過表達(dá)株系葉片的DAB、NBT 和Evans blue 著色淺于野生型對(duì)照，說明轉(zhuǎn)基因株系葉片在脅迫處理下，活性氧積累少于野生型對(duì)照，細(xì)胞損傷程度較低，可以初步證明BpbZIP1 基因能夠提高轉(zhuǎn)基因白樺的抗逆能力。

2.6.2 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺的生理生化指標(biāo)分析

2.6.2.1 SOD 活性測(cè)定 從圖8 可以看出：在NaCl和甘露醇的非生物脅迫下，轉(zhuǎn)BpbZIP1基因株系和WT 的SOD 活性發(fā)生了變化，BpbZIP1 基因的過表達(dá)株系SOD 活性高于WT，說明BpbZIP1 轉(zhuǎn)基因株系的脅迫抗逆能力較WT 的植株強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，BpbZIP1 基因在白樺體內(nèi)有一定的抗逆作用。

2.6.2.2 POD 活性測(cè)定 從圖9 可以看出：在NaCl 和甘露醇的非生物脅迫下，BpbZIP1 轉(zhuǎn)基因株系和WT 的POD 活性發(fā)生了變化，NaCl 脅迫下，BpbZIP1 基因的過表達(dá)株系POD 活性高于WT，甘露醇脅迫變化不明顯，說明BpbZIP1 轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下，保護(hù)酶活性高于WT，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力在一定程度上有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，BpbZIP1基因在白樺體內(nèi)有一定的耐鹽作用。

圖3 BpbZIP1 與bZIP 蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig. 3 Multiple alignment analysis of BpbZIP1 and bZIP protein sequences

圖4 BpbZIP1 基因響應(yīng)鹽、旱脅迫分析Fig. 4 Analysis of BpbZIP1 Gene response to salt and drought treatments

2.7 BpbZIP1 與ABRE 元件結(jié)合分析

2.7.1 BpbZIP1-pGBKT7 載體轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè) 將BpbZIP1-pGBKT7 質(zhì)粒和作為對(duì)照的pGBKT7 空載體轉(zhuǎn)化Y2H 酵母感受態(tài)，將稀釋后的菌液依次涂布在培養(yǎng)基SD/-Trp、SD/-Trp/-His/X-a-Gal、SD/-Trp/-His /-Ade /X-a-Gal 上，培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)（30℃/3 d）。BpbZIP1-pGBKT7 能在一缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但是在二缺和三缺培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。挑取一缺培養(yǎng)基上菌體加入到一缺液態(tài)培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，將適量菌液接種在三缺培養(yǎng)基（含X-a-Gal）上，30℃培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)， BpbZIP1-pGBKT7 沒有藍(lán)斑出現(xiàn)（圖10），說明BpbZIP1基因全長(zhǎng)序列不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖5 BpbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of BpbZIP1 transcription factor

圖6 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺植株BpbZIP1 基因的表達(dá)量分析Fig. 6 Analysis of the expression levels of transgenic B.platyphylla plants

圖8 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺株系SOD 活性分析Fig. 8 SOD activity of transgenic B. platyphylla lines under abiotic stress

圖9 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因白樺株系POD 活性分析Fig. 9 POD activity of transgenic B. platyphylla lines under abiotic stress

圖10 BpbZIP1 轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證Fig. 10 Transcription activation verification of BpbZIP1

2.7.2 BpbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子與ABRE 元件結(jié)合 將ABRE-pHIS2 和pHIS2-AM1-6 突變載體分別同BpbZIP1-pGADT7 載體共轉(zhuǎn)化Y187 酵母細(xì)胞，在篩選之后將一缺培養(yǎng)基上的菌體于一缺液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)震蕩培養(yǎng)，后經(jīng)不同稀釋倍數(shù)后，依次接種于加入30 mmol·L－13-AT 的二缺和三缺培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后長(zhǎng)出菌點(diǎn)。結(jié)果（圖11）表明：在二缺培養(yǎng)基上除了陰性對(duì)照，ABRE 元件與其6 個(gè)突變?cè)L(zhǎng)出正常的菌點(diǎn)，而三缺培養(yǎng)基（30 mmol·L－13-AT）上突變?cè)t無法長(zhǎng)出菌點(diǎn)，表明BpbZIP1轉(zhuǎn)錄因子能夠與ABRE 順式作用元件結(jié)合。

圖11 BpbZIP1 與ABRE 元件結(jié)合分析Fig. 11 Binding analysis between BpbZIP1 and ABRE element

3 討論

本研究鑒定的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，具有該家族結(jié)構(gòu)域的典型特征[28]。系統(tǒng)進(jìn)化和功能分析證實(shí)BpbZIP1基因與擬南芥親緣關(guān)系相近的bZIP基因在非生物脅迫中起到相似的作用。BpbZIP1在NaCl脅迫了48 h 時(shí)表達(dá)量大幅上調(diào)，說明該基因能夠響應(yīng)鹽脅迫；但鹽脅迫后，該基因先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式，可能與植物適應(yīng)外界環(huán)境以及自身保護(hù)機(jī)能的衰退有關(guān)[29]。在甘露醇脅迫時(shí)，BpbZIP1 表達(dá)變化則不明顯，該基因的抗旱功能有待更多的試驗(yàn)證據(jù)來確定。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法是快速確定基因功能的有力工具[21-22]。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，分析BpbZIP1 基因在白樺轉(zhuǎn)基因株系中的耐鹽抗旱能力。植物細(xì)胞中的H2O2能釋放出氧化DAB 的氧離子，產(chǎn)生棕色的沉淀，細(xì)胞受損傷越嚴(yán)重，H2O2釋放的量越多，染色的顏色也就越深，所以，可以根據(jù)顏色深淺判斷細(xì)胞的損傷程度。本研究利用NaCl 鹽和甘露醇處理模擬鹽和干旱脅迫，分析轉(zhuǎn)基因株系耐鹽抗旱性[30]，并進(jìn)行了組織化學(xué)染色和生理指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系和野生型在活性氧積累和保護(hù)酶活性指標(biāo)上發(fā)生了變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系受到脅迫后，過表達(dá)株系DAB 染色的顏色比野生型顏色淺，說明過表達(dá)株系中H2O2積累低于野生型。Evans blue 染色的顏色較野生型淺，說明轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞損傷程度小。植物體的超氧化物歧化酶可以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用。NBT 染色結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞內(nèi)超氧離子的積累少于野生型。綜上所述，組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：BpbZIP1基因的過表達(dá)株系較野生型受鹽害程度低，BpbZIP1基因在白樺轉(zhuǎn)基因體內(nèi)起一定的抗逆作用。

保護(hù)酶能有效地保護(hù)植物細(xì)胞免受損傷[31]。SOD 和POD 是細(xì)胞內(nèi)清除過量活性氧的重要酶促系統(tǒng)[32]。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，體內(nèi)的SOD 和POD含量增高，以便較快地清除植物體內(nèi)的自由基，從而降低植物受傷的程度[33]。本實(shí)驗(yàn)中，保護(hù)酶活性分析同樣印證了組織化學(xué)染色的結(jié)果。當(dāng)植物受到甘露醇和NaCl 脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中的SOD 和POD 含量都高于野生型，說明轉(zhuǎn)基因植株受到脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶含量增高，從而減少損傷。在轉(zhuǎn)BpbZIP1 基因白樺體內(nèi)，抗逆性可能是通過保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)揮作用的。相反，在甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株所測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)都較野生型植株變化不明顯。在基因表達(dá)分析結(jié)果中也顯示，該基因受干旱脅迫誘導(dǎo)不明顯，說明該基因主要具有耐鹽功能。

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以與抗逆相關(guān)的順式作用元件（如ABRE 元件、G-box 元件以及w-box 元件）相互作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)。本研究驗(yàn)證了BpbZIP1 能夠與ABRE 順式作用元件相結(jié)合，為研究白樺抗非生物脅迫性狀形成的分子基礎(chǔ)及林木抗性分子育種提供理論數(shù)據(jù)和研究材料。

4 結(jié)論

克隆獲得白樺BpbZIP1 基因，該基因蛋白序列與已知抗性相關(guān)基因AtbZIP12 蛋白序列聚為一組，定位于細(xì)胞核中表達(dá)；BpbZIP1 基因受NaCl處理的誘導(dǎo)；BpbZIP1 基因能夠通過清除活性氧，減輕細(xì)胞損傷來提高白樺瞬時(shí)轉(zhuǎn)化株系的耐鹽能力，抗旱能力不明顯；BpbZIP1 能夠與逆境相關(guān)ABRE 元件特異性結(jié)合。本研究鑒定出具有耐鹽功能的白樺BpbZIP 轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合元件，為進(jìn)一步分析白樺bZIP 基因的耐鹽分子調(diào)控機(jī)制及白樺耐鹽分子育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和材料。