貯藏溫度對(duì)楓香種子耐貯性的影響

裴云霞，曹 健，杜克兵＊，管蘭華，張 銳，蔣祥娥，蔡 桁，倪天虹

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/湖北林業(yè)信息技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430070；2. 湖北省林業(yè)廳林木種苗管理總站,湖北 武漢 430079)

楓香（Liquidambar formosana Hance）系金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香樹(shù)屬的高大喬木，是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土樹(shù)種，主要分布于淮河、長(zhǎng)江流域以南地區(qū)。由于其生長(zhǎng)迅速，抗逆性強(qiáng)，木材優(yōu)良，秋葉紅色鮮艷，成為我國(guó)亞熱帶地區(qū)重要的用材林、生態(tài)林造林樹(shù)種和秋色葉觀賞樹(shù)種。播種是楓香繁殖的一種重要方法。楓香種子一般于10—11 月成熟，由于種子較小，多進(jìn)行春播繁殖。為保障種子發(fā)芽率和苗木質(zhì)量，采種后多需要進(jìn)行貯藏，以保持種子活力與品質(zhì)[1-2]。已有研究表明，種子含水量與貯藏溫度對(duì)其耐貯性有較大的影響，且種子類(lèi)型不同，適宜的含水量與貯藏溫度亦有所不同[3-4]。如油脂含量高的花生和大豆種子，含水量為5% 時(shí)在－18℃的環(huán)境下貯藏效果較好；淀粉類(lèi)種子（如玉米），當(dāng)含水量為8% 時(shí)適合超低溫貯藏[5-7]。目前，關(guān)于楓香種子的形態(tài)特征、成熟性狀[8]、種子成分[9]、種子萌發(fā)特性[10]、播種育苗技術(shù)[11-13]等已有較多的報(bào)道，但涉及楓香種子貯藏方面的研究還較少，其耐貯性及適宜的貯藏條件尚不明晰。鑒于此，本文以楓香種子為材料，研究不同貯藏溫度對(duì)種子活力的影響，以期了解楓香種子的耐貯性，為楓香種子的科學(xué)貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試楓香種子于2017 年12 月初采于江西廬山。采種時(shí)，隨機(jī)選擇生長(zhǎng)健壯、結(jié)實(shí)量大、無(wú)明顯病蟲(chóng)害的優(yōu)良單株作為采種母樹(shù)。采種母樹(shù)共15 株（胸徑20～30 cm），將其球果曝曬4 d 后收集種子。種子去除雜質(zhì)，均勻混合后作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

種子采集后，首先測(cè)定新鮮種子的千粒質(zhì)量。然后，將種子于室內(nèi)自然陰干至含水量為10.54%。12 月中旬開(kāi)始種子貯藏試驗(yàn)。將種子隨機(jī)分為12 份，分別置于4 個(gè)不同溫度條件下進(jìn)行貯藏。貯藏溫度設(shè)置為室溫（25±2）℃、4℃、－20℃和－70℃，每個(gè)溫度3 份種子（即3 次重復(fù)）。于貯藏0、60、180、300、360、520、730 d 時(shí)分別測(cè)定種子的丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率，并將種子于室內(nèi)播種，測(cè)定發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及播種1 個(gè)月后萌發(fā)幼苗的苗高和根長(zhǎng)。各指標(biāo)的具體測(cè)定方法如下：

1.2.1 千粒質(zhì)量

采用四分法取樣，測(cè)定100 粒種子質(zhì)量（百粒質(zhì)量），然后換算成千粒質(zhì)量，4 次重復(fù)[14]。

1.2.2 含水量 稱(chēng)取一定量的種子（濕質(zhì)量），105℃殺青2 h，然后65℃烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量（干質(zhì)量），4 次重復(fù)。種子含水量=（種子濕質(zhì)量－種子干質(zhì)量）/種子濕質(zhì)量×100%。

1.2.3 發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率 貯藏過(guò)的種子在播種前于室溫下在飽和水蒸汽中（100% 相對(duì)濕度 RH）回濕2 h。隨后，用0.3% 高錳酸鉀消毒2 h，清水漂洗3 次，然后于室溫下浸泡24 h，去除浮粒后采用培養(yǎng)皿進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)[15]。首先，在培養(yǎng)皿內(nèi)墊5 層濾紙，將濾紙用蒸餾水潤(rùn)濕，但無(wú)明顯積水。隨后，將其置于（25±2）℃培養(yǎng)，每天16 h 光照，8 h 黑暗，3 次重復(fù)，每重復(fù)50 粒種子，培養(yǎng)皿完全隨機(jī)排列。發(fā)芽試驗(yàn)第5 天，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢(shì)。發(fā)芽勢(shì)=培養(yǎng)5 d 后的發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù)×100%[16]。發(fā)芽試驗(yàn)第15 天（此時(shí)種子萌發(fā)全部結(jié)束），統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。發(fā)芽率=培養(yǎng)15 d 后的發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù)×100%。

1.2.4 苗高與根長(zhǎng) 自發(fā)芽試驗(yàn)第15 天開(kāi)始，給萌發(fā)的幼苗澆1/2MS 營(yíng)養(yǎng)液，每周3 次，至第30 天時(shí)用直尺測(cè)定幼苗的苗高與根長(zhǎng)。苗高為根莖至幼苗頂芽之間的長(zhǎng)度；根長(zhǎng)為根莖至主根根尖的長(zhǎng)度。

1.2.5 丙二醛含量 貯藏期間，測(cè)定種子的丙二醛（MDA）含量，評(píng)價(jià)種子膜脂過(guò)氧化程度和劣變程度。具體方法如下：分別取種子0.5 g（W），加入5 mL 0.9 g·L－1NaCl 溶液，研磨后所得勻漿在3 000 r·min－1下離心10 min。取上清液1 mL，加入2 mL 0.67%TBA，充分混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷卻后再離心1 次，分別測(cè)定上清液在450、532、600 nm 處的吸光度, 以0.67%TBA 為對(duì)照，計(jì)算MDA 濃度（μmol·g－1），3 次重復(fù)。

MDA 濃度=(6.45×(OD532－OD600)－0.56×OD450)×0.03/W[17]

1.2.6 相對(duì)電導(dǎo)率 貯藏期間，測(cè)定種子的相對(duì)電導(dǎo)率，評(píng)價(jià)細(xì)胞膜受損程度和種子劣變程度。試驗(yàn)方法如下：稱(chēng)取種子2 g，用蒸餾水快速清洗3 次，用濾紙吸干種子表面水分。隨后，將清洗過(guò)的種子放入50 mL 離心管中，添加20 mL 蒸餾水，于25℃下浸種24 h 后測(cè)定電導(dǎo)率EC1。隨后，將種子置于100℃沸水浴15 min，自然冷卻10 min 后再測(cè)定電導(dǎo)率EC2，3 次重復(fù)。

相對(duì)電導(dǎo)率= EC1/ EC2×100%[17]

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、MDA 含量、相對(duì)電導(dǎo)率、苗高與根長(zhǎng)等指標(biāo)進(jìn)行方差分析（ANOVA）與多重比較（Duncan’s），評(píng)價(jià)不同處理間的差異顯著性，其中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)電導(dǎo)率的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)反正弦轉(zhuǎn)換后再用于方差分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 貯藏溫度對(duì)種子發(fā)芽率的影響

試材楓香種子的千粒質(zhì)量為39.6 g。貯藏試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（0 d），含水量為10.54%，發(fā)芽率為77.0%。

方差分析顯示，貯藏溫度（ANOVA，3 df，F(xiàn)=3.17，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6 df，F(xiàn)=5.77，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18 df，F(xiàn)=6.19，p＜0.05）均對(duì)種子的發(fā)芽率有顯著影響（圖1）。貯藏180 d 時(shí)，4 種溫度下種子發(fā)芽率的變化幅度均較小，不同溫度相互之間差異不顯著；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度之間發(fā)芽率的差異逐漸加大；至520 d 時(shí)，室溫下的發(fā)芽率最低，－70℃最高，4℃與－20℃介于中間，二者之間差異不明顯；至730 d 時(shí)，4 種溫度下發(fā)芽率的排序與520 d時(shí)一致，但不同溫度之間的差異進(jìn)一步增加。此時(shí)，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的發(fā)芽率分別為51.33%、71.33%、70.0% 和78.67%，相比于0 d 時(shí)的發(fā)芽率，分別降低25.67%、5.67%、7.00%和－1.67%?？梢?jiàn)，楓香種子在含水量為10.54% 時(shí)，低溫（4℃、－20℃）和超低溫（－70℃）的貯藏效果明顯優(yōu)于室溫，其中，－70℃的貯藏效果最好。

圖1 不同貯藏溫度下種子發(fā)芽率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 1 Changes of seed germination rates with time at different storage temperatures

2.2 貯藏溫度對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F(xiàn)=161.39，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6df，F(xiàn)=38.83，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F(xiàn)=49.75，p＜0.05）均對(duì)楓香種子的發(fā)芽勢(shì)有顯著影響（圖2）。貯藏0 d時(shí)，種子的發(fā)芽勢(shì)為62.67%；至360 d 時(shí)，4 個(gè)溫度下種子的發(fā)芽勢(shì)均無(wú)明顯變化，且不同溫度之間的差異不明顯；貯藏至520 d 時(shí)，－70℃、－20℃和4℃條件下種子的發(fā)芽勢(shì)變化仍不明顯，而室溫條件下的發(fā)芽勢(shì)明顯降低；至730 d時(shí)，－70℃、－20℃和4℃條件下種子的發(fā)芽勢(shì)略低于0 d 時(shí)的發(fā)芽勢(shì)，而室溫條件下的發(fā)芽勢(shì)顯著降低。此時(shí)，室溫、4℃、－20℃和－70℃的發(fā)芽勢(shì)分別為5.0%、54.67%、52.00% 和61.33%，與0 d 相比分別降低57.67%、8.00%、10.67% 和1.34%，這與發(fā)芽率的結(jié)果一致。

圖2 不同貯藏溫度下種子發(fā)芽勢(shì)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 2 Changes of seed germination potential with time at different storage temperatures

2.3 貯藏溫度對(duì)幼苗苗高的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F(xiàn)=4.31，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6df，F(xiàn)=6.39，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F(xiàn)=11.25，p＜0.05）均對(duì)幼苗的苗高有顯著影響（圖3）。貯藏0 d 時(shí)，幼苗的苗高為2.19 cm；至360 d 時(shí)，4 種貯藏溫度下幼苗的苗高均無(wú)明顯變化，與0 d 時(shí)的苗高基本相同，不同溫度之間差異不明顯（圖3）；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度之間苗高的差異逐漸加大；至520 d 時(shí)，－70℃、－20℃和4℃條件下的苗高仍與0 d 時(shí)相似，無(wú)明顯變化，而室溫條件下的苗高顯著降低；貯藏至730 d 時(shí)，－70℃、－20℃和4℃條件下的苗高與0 d 時(shí)差異不顯著，而室溫條件下的苗高再次大幅下降。此時(shí)，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的苗高分別為1.30、2.19、2.17、2.12 cm，相比于0 d 時(shí)的苗高，分別降低40.64%、0.00%、0.91% 和3.20%。

圖3 不同貯藏溫度下幼苗的苗高隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 3 Changes of seedling height with time at different storage temperatures

2.4 貯藏溫度對(duì)幼苗根長(zhǎng)的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F(xiàn)=3.06，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6df，F(xiàn)=5.83，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F(xiàn)=9.41，p＜0.05）均對(duì)幼苗的根長(zhǎng)有顯著影響（圖4）。貯藏0 d 時(shí)，幼苗的根長(zhǎng)為3.68 cm；至360 d 時(shí)，4 種溫度下幼苗的根長(zhǎng)變化不明顯，與0 d 時(shí)的根長(zhǎng)差異不顯著，4 種溫度之間差異亦不顯著；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度之間根長(zhǎng)的差異逐漸加大；貯藏至520 d 時(shí)，室溫下的根長(zhǎng)最短，－70℃最長(zhǎng)，4℃與－20℃介于中間，二者之間差異不顯著；至730 d 時(shí)，4 種溫度下根長(zhǎng)的排序與520 d時(shí)一致，但不同溫度之間的差異進(jìn)一步增加， 室溫、 4℃、－20℃和－70℃條件下的根長(zhǎng)分別為0.74、3.65、3.48、 4.30 cm， 相比于0 d時(shí)的根長(zhǎng)分別降低79.89%、0.82%、5.43% 和－16.85%。

圖4 不同貯藏溫度下幼苗根長(zhǎng)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 4 Changes of root length with time at different storage temperatures

2.5 貯藏溫度對(duì)丙二醛含量的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F(xiàn)=56.25，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6df，F(xiàn)=2.70，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F(xiàn)=2.75，p＜0.05）均對(duì)種子的丙二醛含量有顯著影響（圖5）。4 種溫度條件下，種子中丙二醛的含量均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，尤以室溫條件下的上升速度最快；貯藏至360 d 時(shí)，4 個(gè)溫度之間種子丙二醛含量差異不明顯；至520 d 時(shí)，室溫條件下丙二醛的含量明顯高于4℃、－20℃和－70℃，后三者之間差異不明顯；貯藏至730 d 時(shí)，室溫條件下丙二醛的含量進(jìn)一步大幅增加，－20℃居中，略高于4℃和－70℃。此時(shí)，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的丙二醛含量分別是0 d 時(shí)的3.12、2.09、2.39、2.05 倍。

圖5 不同貯藏溫度下種子丙二醛含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 5 Changes of seed malonaldehyde content with time at different storage temperatures

2.6 貯藏溫度對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F(xiàn)=2 255.75，p＜0.05）、時(shí)間（ANOVA，6df，F(xiàn)=127.12，p＜0.05）及其交互作用（ ANOVA， 18df，F(xiàn)=80.96，p＜0.05）均對(duì)種子的相對(duì)電導(dǎo)率有顯著影響（圖6）。貯藏0 d 時(shí)，種子的相對(duì)電導(dǎo)率最低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，以貯藏60～180 d上升速度最快（圖6）；貯藏至520 d 時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率與0 d 相比顯著升高（p＜0.05），且室溫的相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于另外3 種溫度的；至730 d 時(shí)，室溫與另外3 種溫度之間的相對(duì)電導(dǎo)率差異進(jìn)一步增加，此時(shí)，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的相對(duì)電導(dǎo)率分別為95.45%、82.87%、80.75% 和79.51%，分別是0 d 時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的2.10、1.82、1.77 和1.75 倍?？梢?jiàn)，室溫條件下相對(duì)電導(dǎo)率最高，4℃、－20℃、－70℃之間的差異不明顯，與丙二醛含量的結(jié)果基本一致。

圖6 不同貯藏溫度下種子相對(duì)電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig. 6 Changes of seed relative membrane permeabilities with time at different storage temperatures

3 討論

種子萌發(fā)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，受播種環(huán)境和種子活力的綜合影響[18]。在適宜的播種環(huán)境下，種子活力是決定種子發(fā)芽和出苗期間活力強(qiáng)度等特性的綜合表現(xiàn)[19]。高活力種子具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力，對(duì)生產(chǎn)具有重要的意義[20]。種子采收后進(jìn)行科學(xué)貯藏是保持其活力的重要方面。貯藏溫度、濕度、基質(zhì)和時(shí)間等因素均會(huì)對(duì)種子活力的保持產(chǎn)生重要影響[21]。

本研究中，貯藏溫度和時(shí)間均對(duì)楓香種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)有顯著影響。室溫、4℃、－20℃和－70℃貯藏的種子在360 d 時(shí)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較0 d 略有降低，且不同溫度之間差異并不明顯；至520 d 時(shí)，室溫種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)開(kāi)始明顯低于4℃、－20℃和－70℃的種子；至730 d 時(shí)，這種差異進(jìn)一步增加?？梢?jiàn)，低溫和超低溫條件下貯藏的楓香種子始終保持著較高的活力，以－70℃貯藏效果最佳，這與其它植物種子的貯藏試驗(yàn)結(jié)果相似。如獨(dú)活（Heracleum hemsleyanumDiels）種子的貯藏溫度以－15℃最佳[22]；桃葉衛(wèi)矛（Euonymus bungeanusMaxim）的種子在－20℃條件下貯藏可有效保持種子活力[23]。這可能是由于低溫影響了種子內(nèi)部酶的活性、代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和氣體交換，降低了呼吸強(qiáng)度，減少了胚活性物質(zhì)的消耗[24]。不同植物種子適宜的貯藏溫度也存在一定的差異。張雪娟等[25]通過(guò)對(duì)4 個(gè)居群的馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi Franch.）種子的貯藏研究，發(fā)現(xiàn)貯藏310 d時(shí)，4℃種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率高于常溫和－20℃，但不同種群之間的差異顯著性有所不同。

幼苗的生長(zhǎng)速度與質(zhì)量是評(píng)價(jià)種子活力的另一個(gè)重要指標(biāo)[26]。本試驗(yàn)中，幼苗苗高與根長(zhǎng)的變化趨勢(shì)與種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的變化趨勢(shì)一致。貯藏360 d 時(shí)，4 種溫度之間幼苗苗高與根長(zhǎng)的差異并不明顯；至520 d 時(shí)，室溫種子的苗高與根長(zhǎng)開(kāi)始明顯低于4℃、－20℃和－70℃種子，并隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，差異逐漸變大。4℃、－20℃和－70℃條件下貯藏的種子始終保持著較高的苗高與根長(zhǎng)生長(zhǎng)量，以－70℃貯藏效果最佳。這與杜克兵等[27]對(duì)遼寧楊（Populus liaoningensis Z.Wang et H.D.Chen cv.nov）種子（含水量10.52%）貯藏的研究結(jié)果一致，該研究認(rèn)為，遼寧楊種子在進(jìn)行短、中期（＜56 d）貯藏時(shí)，4℃及以下低溫即可有效保持幼苗的苗高與根長(zhǎng)生長(zhǎng)量，而更長(zhǎng)期（110 d）的貯藏則以－70℃更適合?？梢?jiàn)，當(dāng)種子的含水量適宜時(shí)，低溫貯藏可以延緩種子的老化，有效保持種子的活力和幼苗生長(zhǎng)的潛能[28]。

丙二醛含量與相對(duì)電導(dǎo)率常被用作種子活力的鑒定指標(biāo)，指示種子劣變的程度[29-30]。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，可以反映細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度[31]。當(dāng)植物組織受到逆境脅迫時(shí)，往往產(chǎn)生細(xì)胞膜功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致其透性增大，細(xì)胞內(nèi)的鹽類(lèi)或有機(jī)物滲出，引起組織浸泡液電導(dǎo)率發(fā)生變化[32]。隨著種子劣變程度的加深，其丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升，細(xì)胞膜完整性逐漸喪失[33-35]。本研究中，楓香種子的丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，但貯藏溫度不同，變化幅度有所差異，以室溫條件下上升最快，－70℃最慢，4℃和－20℃介于中間。這一結(jié)果與水稻(Oryza sativa L.)[30]、大豆(Glycine max(Linn.) Merr.)[6]等種子的貯藏試驗(yàn)結(jié)果一致。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與種子膜脂過(guò)氧化作用、染色體及基因的畸變以及胚蛋白的降解等有關(guān)[36]。

4 結(jié)論

當(dāng)楓香種子的含水量為10.54% 時(shí)，不同溫度條件下的種子隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗苗高與根長(zhǎng)逐漸降低，丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率逐漸升高。對(duì)于4 種貯藏溫度之間，其種子活力的相關(guān)指標(biāo)（發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗苗高與根長(zhǎng)）以及種子受損程度的相關(guān)指標(biāo)（丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率）在360 d 時(shí)仍無(wú)明顯差異，至520 d 時(shí)差異逐漸顯現(xiàn)，730 d 時(shí)差異進(jìn)一步增加?？傮w而言，貯藏360 d 時(shí)，室溫即可取得較好的貯藏效果；當(dāng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，4℃、－20℃、－70℃更有利于保持種子活力，其貯藏效果明顯優(yōu)于室溫，其中，以－70℃的貯藏效果最佳。