深層過濾在口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用研究

范恒瑞，宋明宇，邱 瑾，吳 迪

(3M中國有限公司，北京 大興 100176)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，本病最易感染的動(dòng)物包括牛、豬、羊等?？谔阋咴趤喼?、非洲、中東和南美均有流行，發(fā)病率極高，傳播速度極快。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類人獸共患病首位，要求成員國將口蹄疫列入必須報(bào)告動(dòng)物疾病的名錄中[1]。疫苗接種是特異性預(yù)防FMD的有效手段。FMD滅活疫苗由完整病毒經(jīng)過滅活劑滅活后制成，在預(yù)防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用[2]。

FMDV本身抗原性較差，病毒滅活后對(duì)其抗原的影響較大，所以現(xiàn)階段口蹄疫疫苗生產(chǎn)中，高純度的口蹄疫疫苗能保證單位使用劑量中抗原含量和純度，這顯得尤為重要，也是目前疫苗接種的策略。這對(duì)于病毒的下游純化提出了很高的要求。另外，2009年以前，國內(nèi)滅活口蹄疫疫苗上游多為采用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)方式，隨著對(duì)于疫苗需求的提升，該培養(yǎng)方式需大量轉(zhuǎn)瓶、效率低下、表達(dá)量低的弊端逐漸顯現(xiàn)。因此，近年來細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)由以往的貼壁培養(yǎng)慢慢向懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)變，病毒產(chǎn)量得到了顯著提高[3]。然而，隨著病毒產(chǎn)量的提高，培養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，給下游純化帶來更大的壓力，因?yàn)榘殡S培養(yǎng)過程產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、細(xì)胞釋放宿主蛋白、宿主DNA等相應(yīng)也劇增，這對(duì)于下游純化的能力提出了進(jìn)一步的要求。

膜過濾技術(shù)廣泛應(yīng)用于疫苗等生物制品的生產(chǎn)過程中，其中直流過濾技術(shù)通常應(yīng)用于病毒液的收獲過程，用以分離細(xì)胞碎片等不溶性雜質(zhì)。早期的FMDV澄清主要采用以折疊膜濾芯為代表的表面過濾技術(shù)；隨著培養(yǎng)條件的變化，細(xì)胞碎片雜質(zhì)的增多，表面過濾難以達(dá)到澄清效果，而且由于表面過濾載量較低，濾材成本也越來越高。在上述背景下，深層過濾在FMDV的胞液分離過程得到越來越多的應(yīng)用。深層過濾濾材通常由天然來源的長細(xì)纖維構(gòu)成，過濾介質(zhì)成膜后形成的通道往往都十分曲折，類似迷宮式的孔徑結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)顆粒往往在濾材內(nèi)部而非表面被截留捕捉。而且，過濾通道壁面往往會(huì)以靜電作用或者分子間作用力的方式吸附一部分極其細(xì)小的顆粒雜質(zhì)。總體而言，深層過濾的過濾機(jī)理表現(xiàn)為機(jī)械截留和吸附作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液BHK21 懸浮培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)流離心工藝離心上清液。

1.2 主要儀器 2100Q便攜式濁度儀，哈希公司產(chǎn)品；蠕動(dòng)泵，Cole Parmer公司產(chǎn)品；47 mm過濾夾持器，3M公司產(chǎn)品；Zeta PlusTM深層過濾濾材，型號(hào):60SP、60ZB、30SP、30ZB，3M公司產(chǎn)品。

1.3 恒流過濾方法 安裝深層濾板至恒流過濾裝置，用緩沖液PBS沖洗濾板54 L/m2以上；沖洗完畢后啟動(dòng)蠕動(dòng)泵緩慢泵入料液，緩慢調(diào)節(jié)泵速至約預(yù)計(jì)流速，進(jìn)行料液過濾；記錄過濾過程濾出體積、時(shí)間、壓差、濁度。收集濾出液進(jìn)行抗原檢測。

2 結(jié)果

2.1 深層過濾的優(yōu)勢 表面過濾是通過濾材表面對(duì)顆粒進(jìn)行捕捉截留來實(shí)現(xiàn)過濾的技術(shù)。過濾機(jī)理主要是依據(jù)流體中顆粒大小進(jìn)行篩分，大顆粒被截留在濾膜表面。深層過濾利用內(nèi)部通道，在深度進(jìn)行顆粒攔截以及吸附[4]。二者對(duì)比示意圖如圖1所示。

圖1 深層過濾和表面過濾[5]

取某廠家的口蹄疫疫苗滅活液，分別采用0.45 μm 孔徑的聚丙烯材質(zhì)表面膜和深層濾板進(jìn)行預(yù)過濾去除細(xì)胞碎片，然后再用0.2 μm孔徑的除菌過濾器進(jìn)行過濾?？蔀V性數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液深層過濾和表面過濾可濾性測試對(duì)比

該口蹄疫疫苗滅活液濁度為77 NTU，如果直接進(jìn)行除菌過濾，大量細(xì)胞碎片勢必造成0.2 μm濾膜很快堵塞，進(jìn)而影響146S病毒粒子的透過性。因此，在除菌過濾之前設(shè)計(jì)了預(yù)過濾，并且對(duì)比了深層過濾和表面過濾這2種預(yù)過濾方式。選取雙層深層濾板30ZB+60ZB進(jìn)行過濾，載量641 L/m2，深層過濾將77 NTU的物料降低至9.65 NTU，澄明透亮；而0.45 μm的表面過濾載量僅僅46 L/m2，濾出液濁度高達(dá)41 NTU，不適合作為預(yù)過濾。從后續(xù)0.2 μm 除菌過濾的載量對(duì)比上可見，深層過濾后除菌濾膜載量為655 L/m2，是對(duì)應(yīng)表面過濾后除菌過濾載量(僅91 L/m2)的7.2倍。

146S檢測結(jié)果表明，深層過濾系統(tǒng)收率整體高于表面過濾系統(tǒng)。深層過濾載量是表面過濾的13.9倍，濾出液濁度僅為表面過濾的23.5%，后續(xù)0.2 μm除菌過濾載量是表面過濾的7.2倍。因此，無論從成本角度還是從收率角度考慮，深層過濾系統(tǒng)都明顯優(yōu)于表面膜過濾系統(tǒng)。

2.2 強(qiáng)正電荷深層濾器的優(yōu)勢 針對(duì)不同來源的口蹄疫疫苗滅活液，采用正電荷深層濾板和強(qiáng)正電荷深層濾板進(jìn)行對(duì)比測試?？蔀V性結(jié)果如表2所示，過濾過程濾速壓差變化如中插彩版圖2所示。

表2 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液強(qiáng)正電荷深層過濾可濾性參數(shù)

所采用的兩組深層濾板具有一樣的孔徑精度，從載量、壓差變化等角度看，表現(xiàn)非常一致，中插彩版圖2中壓差變化曲線也基本重合。但是從濾出液濁度來看，差異很大。普通正電荷的30SP+60SP雙層濾板的濾出液25 NTU，而同樣孔徑的強(qiáng)正電荷深層濾板30ZB+60ZB雙層濾板的濾出液僅9.65 NTU，僅為普通深層濾板的38.6%。這主要得益于強(qiáng)正電荷深層濾板濾材中特殊的樹脂配基。通過強(qiáng)正電荷雙層濾板，濁度降低至10 NTU以下，細(xì)胞碎片被充分吸附或者截留，有利于后續(xù)超濾或者除菌過濾工藝。除了對(duì)于不可溶性的細(xì)胞碎片有吸附作用，Yigzaw Y等[6]還曾報(bào)道過強(qiáng)正電荷深層濾板對(duì)于細(xì)胞宿主蛋白的去除作用，Dorsey N等[7]報(bào)道過強(qiáng)正電荷深層濾板對(duì)于DNA的去除作用。

2.3 深層過濾對(duì)口蹄疫疫苗上清液的澄清過濾工藝建立 通過上述表面過濾和深層過濾的對(duì)比研究、特殊的強(qiáng)正電荷深層濾板澄清效果的研究，針對(duì)不同培養(yǎng)條件產(chǎn)生的口蹄疫疫苗滅活上清液，應(yīng)該給予匹配不同的過濾方案。低濁度、中等濁度、高濁度3種不同濁度的離心上清液，深層過濾方案及相應(yīng)過濾參數(shù)如表3所示。

表3 不同濁度口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液的過濾方案

對(duì)于較低濁度的離心上清，單層深層濾板可以有效澄清，去除少量的細(xì)胞碎片；對(duì)于中等濁度的離心上清，雙層深層濾板可以有效澄清，尤其是強(qiáng)正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板可以將濁度降低至5 NTU以下；對(duì)于較高濁度的離心上清，SP及ZB的組合濾板可以有效澄清。無論哪一種工藝，處理量均在500～800 L/m2，濾出液濁度均低于20 NTU，目標(biāo)抗原均完全回收，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

3 討論

20世紀(jì)70年代，過濾介質(zhì)被規(guī)定不得采用石棉材料，因?yàn)槭薏牧现写嬖谥掳┪镔|(zhì)。后來，科學(xué)家Cuno發(fā)明了Zeta PlusTM濾材，該濾材不含有石棉，但有更強(qiáng)的正電荷。該濾材由木質(zhì)纖維基體和助濾劑混制而成，生產(chǎn)過程中利用高分子樹脂連接基本成分，其中的正電荷功能基團(tuán)有效賦予了深層濾材電荷吸附的能力。Hou K等[8]報(bào)道了Zeta PlusTM吸附型深層過濾在細(xì)小顆粒的捕捉能力上的優(yōu)異表現(xiàn)，如圖3所示。

圖3 深層過濾介質(zhì)靜電吸附/機(jī)械攔截示意圖[4,8]

本試驗(yàn)選取不同樹脂成分、不同精度的Zeta PlusTM濾材對(duì)FMDV培養(yǎng)液進(jìn)行澄清過濾測試，并與表面過濾進(jìn)行對(duì)比測試。結(jié)果顯示，深層過濾相對(duì)于表面過濾更加適合于細(xì)胞碎片的去除，有利于后續(xù)微生物負(fù)荷控制過濾單元(0.2 μm)。另外，通過對(duì)比強(qiáng)正電荷深層濾板和普通正電荷深層濾板的過濾效果，強(qiáng)正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板顯示了極強(qiáng)的濁度控制能力，可以將濁度降低至5 NTU 以下，非常有利于提高整個(gè)過濾工藝的穩(wěn)健性。

上游培養(yǎng)工藝對(duì)于有效成分收獲步驟的影響巨大，本試驗(yàn)通過測試最終建立了針對(duì)不同濁度的細(xì)胞培養(yǎng)液的可規(guī)?；倪^濾方案，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。