蒲公英根提取物自微乳給藥系統(tǒng)的處方設(shè)計(jì)

王麗娜，賈 皓，于 同，王 丹，陳 爽，李 研

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，海南 ?？?570000)

自微乳給藥系統(tǒng)(Self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)屬于各項(xiàng)同性系統(tǒng)，其外觀是澄清透明的，而且呈現(xiàn)穩(wěn)定的熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，可以在體內(nèi)蠕動(dòng)后或在體外加水?dāng)嚢锠顟B(tài)下自發(fā)地進(jìn)行乳化作用，其粒徑為10～100 nm，是屬于水包油(O/W)型的微乳[1-5]，在一定溫度的條件下長(zhǎng)時(shí)間地放置或離心后都顯示比較穩(wěn)定的狀態(tài)，而且一般粘性都較小，因此可以通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行滅菌，極其便于操作；因?yàn)槠湫纬傻奈⑷榱蕉急容^小，所以可以作為納米級(jí)別的給藥系統(tǒng)，極大地增加了藥物的表面積，同時(shí)也有利于對(duì)藥物的吸收利用，還可以增大難溶性藥物的溶出度，從而使難溶性藥物在體內(nèi)的生物利用度增大[6-8]。SMEDDS在口服后可以在胃腸道的蠕動(dòng)下及胃腸道內(nèi)水的參與下自發(fā)地形成水包油型微乳，能快速均勻地分布在胃腸道中，有利于增強(qiáng)胃腸道對(duì)藥物的吸收利用；除了可以減輕藥物對(duì)胃腸道的刺激外，還可以進(jìn)一步增大體外的溶出度，同時(shí)還能使藥物在體內(nèi)的吸收率增大；另外，還可使胃腸黏膜的清除作用有效地降低，除上述之外，還可以避免首過(guò)效應(yīng)，對(duì)防止藥物被酶水解失活具有一定的作用，從而使藥物的生物利用度增大，另外也可使藥物在個(gè)體間的吸收差異降低，尤其適用于口服吸收效果差及生物利用度低的藥物[9-11]。

蒲公英是一種極其常見的植物，擁有多種多樣的別名，常被稱為婆婆丁，也被稱為黃花地丁等[12]。在全球范圍內(nèi)分布廣泛，遍布于北半球溫帶至亞熱帶中部地區(qū)；我國(guó)也擁有非常多的蒲公英，大多分布在華北、東北、西南省區(qū)以及西北省區(qū)，另外在東南及華南省區(qū)也有少量分布。蒲公英有著清熱解毒及利尿散結(jié)的功效，因此常被作為中草藥和野生蔬菜使用，屬藥食同源類中藥材。藥理作用有抗腫瘤、廣譜抗菌、免疫調(diào)節(jié)等,被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，如常被用于急性乳腺炎、尿路感染等疾病的治療[13]。

蒲公英具有很多種的化學(xué)成分，主要包括咖啡酸、三萜類黃酮類、酚酸類、倍半萜內(nèi)酯類、植物甾醇類和香豆素類等化合物[14]。目前已經(jīng)開發(fā)出來(lái)的蒲公英藥物劑型包括片劑、注射劑等，但在自微乳方面還未有涉足，本試驗(yàn)旨在更加深入地研究利用蒲公英，發(fā)揮其最大價(jià)值，同時(shí)為新劑型的開發(fā)提供基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：331-39-5),購(gòu)自北京盛世康普化工技術(shù)研究院；咖啡酸，購(gòu)自湖北鑫鳴泰化學(xué)有限公司；1，2-丙二醇、鹽酸、甲醇、乙醇，均購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；薄荷油，購(gòu)自黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司；吐溫60、吐溫40、吐溫80、油酸乙酯、聚乙二醇400，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器 日本島津LC-20AT高效液相色譜儀；LC-20AT泵；LC-solution色譜工作站；ZRS-8G型溶出度測(cè)試儀，購(gòu)自上海書培試驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；TG16MW型臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司；ZS90型粒度分析儀、恒溫磁力加熱攪拌器(IKA)、0.45 μm微孔濾膜，均購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒲公英根提取物干燥粉末的制備 將75%乙醇回流提取液少量多次加入到蒸發(fā)皿里，將蒸發(fā)皿放置在烘箱中，調(diào)節(jié)溫度為100 ℃，待蒸發(fā)至完全干燥不黏稠時(shí)，取出置于室溫下，待冷卻后用藥匙刮下干燥粉末，放置在研缽中研碎后過(guò)100目篩，避光干燥保存。

2.2 空白自微乳的處方篩選

2.2.1 藥物的溶解度測(cè)定 分別稱取過(guò)量且質(zhì)量相同的蒲公英根提取物干燥粉末，加入到燒杯里，再分別取1 mL薄荷油、油酸乙酯、油酸加入到其中，在37 ℃恒溫水浴下加熱10 min，直到不再溶解，再分別測(cè)定咖啡酸、總黃酮的含量。

同法測(cè)定藥物在乳化劑吐溫40、吐溫60、吐溫80中的溶解度，通過(guò)觀察判斷可以得出，藥物在其中的溶解度順序?yàn)椋和聹?0>吐溫60>吐溫40，同樣，藥物在助乳化劑即甘油、乙醇、PEG-400、1，2-丙二醇中的溶解度順序?yàn)椋?，2-丙二醇>甘油>乙醇>PEG-400。根據(jù)藥物在各物質(zhì)中的溶解度可以確定最終自微乳處方的油相為薄荷油，乳化劑為吐溫80，助乳化劑為1，2-丙二醇。見表1。

表1 藥物在不同油相中的溶解度

2.2.2 偽三元相圖的繪制

2.2.2.1 自微乳Km值的確定 設(shè)定固定油相與混合表面活性劑的質(zhì)量比為1∶1，分別按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的質(zhì)量比例精密稱取乳化劑與助乳化劑，放入到干燥潔凈的燒杯中，再加入油相，在(37±0.5)℃的恒溫水浴中、在轉(zhuǎn)速為500 r/min的條件下進(jìn)行磁力攪拌，先將自微乳混合均勻，再將水逐滴加入其中。肉眼觀察其外觀變化，在某一刻能形成澄清透明，或帶有少許藍(lán)色乳光的溶液，此時(shí)即為形成微乳的臨界點(diǎn)，將該點(diǎn)確定為偽三元相圖中可形成微乳的區(qū)域點(diǎn)(不包含水相邊線)，準(zhǔn)確記錄加水量，計(jì)算形成微乳臨界點(diǎn)時(shí)各組分所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[15]，從而繪制偽三元相圖。相圖的3個(gè)頂點(diǎn)分別是油相、混合表面活性劑和水相，用Orign 8.0軟件繪制偽三元相圖，確定所成微乳區(qū)面積，篩選乳化劑和助乳化劑的最佳質(zhì)量比，即Km值。偽三元相圖如圖1所示，當(dāng)乳化劑與助乳化劑比例為5∶5時(shí)，即Km值為1時(shí)所形成微乳區(qū)域的面積最大。以偽三元相圖中形成微乳區(qū)域的面積和溶液外觀作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇最佳乳化劑、助乳化劑的比例，當(dāng)Km=1時(shí)所形成的微乳澄清透明，并帶有藍(lán)色乳光，在放置48 h后不分層，其他比例的微乳均有明顯分層現(xiàn)象，當(dāng)乳化劑∶助乳化劑為1∶9時(shí)進(jìn)入凝膠區(qū)，呈透明黏稠液體，轉(zhuǎn)子停止轉(zhuǎn)動(dòng)，不利于在體內(nèi)自發(fā)乳化。見圖1。

圖1 篩選自微乳給藥系統(tǒng)Km值的偽三元相圖

2.2.2.2 篩選油相與混合表面活性劑最優(yōu)比例 固定乳化劑與助乳化劑Km值為1，改變油相所占比例，使其比例分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，混合表面活性劑的比例隨之發(fā)生相應(yīng)改變，即乳化劑與助乳化劑均分別為45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%，按“2.2.2.1”項(xiàng)操作，篩選最優(yōu)比例。其中當(dāng)油相比例占10%時(shí)，加水?dāng)嚢韬蟪庶S色油狀液體，無(wú)變化，不能形成微乳；當(dāng)油相比例占20%時(shí)，加水?dāng)嚢韬笕芤撼吻逋该髑矣忻黠@藍(lán)色乳光出現(xiàn)。偽三元相圖中形成微乳區(qū)域面積表明當(dāng)薄荷油比例為20%、吐溫80比例為40%、1，2-丙二醇比例為40%時(shí)為最優(yōu)處方，外觀也呈明顯澄清透明且有藍(lán)色乳光的溶液。偽三元相圖見圖2。

圖2 篩選油相與混合表面活性劑最優(yōu)比例

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.3.1 蒲公英根提取物自微乳的制備 分別按比例精密稱取油相、乳化劑和助乳化劑，再稱取過(guò)量蒲公英根干燥提取物加入其中，在60 ℃恒溫水浴中，轉(zhuǎn)速為500 r/min的條件下在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，以促進(jìn)藥物在自微乳中的溶解，然后在37 ℃ 恒溫水浴中平衡10 min，12 000 r/min離心10 min 后，取上清液即得加藥自微乳。

2.3.2 蒲公英根提取物自微乳粒徑的測(cè)定 稱取蒲公英根提取物自微乳至燒杯中，再加入25倍(37±0.5)℃的蒸餾水，在轉(zhuǎn)速為500 r/min的條件下，保持水浴(37±0.5)℃，磁力攪拌均勻后，再用馬爾文激光粒度儀測(cè)定所形成自微乳的粒徑。

2.3.3 蒲公英根提取物自微乳總黃酮載藥量的測(cè)定 制備加藥自微乳，用1 mL移液管精密移取1 mL上清液加入到10 mL容量瓶里，再用濃度為75%的乙醇定容到刻度線處，搖晃均勻后，從其中取出1 mL溶液，進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定。

2.3.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方 在偽三元相圖篩選空白自微乳處方的基礎(chǔ)上，選擇影響自微乳性質(zhì)較大的2個(gè)因素，將油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)及Km(X2)作為考察因素，采用偽三元相圖法對(duì)Km值進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)Km=4 時(shí)，有較大面積凝膠區(qū)域出現(xiàn)，因此Km的范圍為1～3；自微乳體系的形成與油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)所占比例有關(guān)，當(dāng)油相所占比例越小，則SMEDDS越容易形成，故將油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍設(shè)置在10%～40%。以咖啡酸載藥量、總黃酮載藥量和粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化[16-17]，因素水平如表2所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.4.1 模型擬合 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)需要對(duì)各因素水平進(jìn)行非線性擬合，即二項(xiàng)式擬合，因此運(yùn)用Design Expert 8.0.6 軟件，做出二項(xiàng)式擬合的模型，其結(jié)果分別為：

黃酮載藥量(Y1)=-21.105 53+0.810 79A+291.145 65B-0.422 51AB-6.51A2-22.89B2(R=0.975)；

咖啡酸載藥量(Y2)=137.238 69+0.672 89A+13.291 435B+107.2 491 235AB-29.489 5A2-46.365 85B2(R=0.949)；

粒徑(Y3)=219.781 86+0.754 97A-237.791 47B+0.854 18AB-0.030 482A2+55.252 04B2(R=0.928)。

二項(xiàng)式擬合方程的相關(guān)系數(shù)分別是0.975、0.949和0.928，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到較高值，該設(shè)計(jì)模型擬合效果良好，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可以用該模型對(duì)蒲公英根提取物自微乳處方進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[18]。

2.3.4.2 效應(yīng)面優(yōu)化 采用Design Expert 8.0.6 軟件，分別繪制2種不同影響因素對(duì)于3個(gè)響應(yīng)值的三維曲線，黃酮載藥量的效應(yīng)曲面如中插彩版圖3所示，咖啡酸載藥量的效應(yīng)曲面如中插彩版圖4所示，粒徑的效應(yīng)曲面如中插彩版圖5所示。根據(jù)方程和響應(yīng)面圖確定蒲公英根提取物自微乳的最優(yōu)處方為：油相比例為35.61%，Km=1.58；黃酮載藥量理論值為26.345 8 mg/g，咖啡酸載藥量理論值為21.987 9 mg/g，粒徑理論值為51.528 7 nm。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)軟件優(yōu)化所得的最佳處方，制備蒲公英根提取物自微乳驗(yàn)證試驗(yàn)，并分別對(duì)黃酮、咖啡酸載藥量和粒徑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)可以證明,最優(yōu)處方粒徑和載藥量的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間存在顯著性差異，說(shuō)明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的模型具有預(yù)測(cè)性良好的特點(diǎn)，可以較好地應(yīng)用于蒲公英根提取物自微乳給藥系統(tǒng)的處方篩選優(yōu)化。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)多種不同條件下蒲公英根提取物進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，選擇黃酮含藥量最多的提取液，進(jìn)一步進(jìn)行處理，在制備蒲公英根自微乳時(shí)使用。油相的篩選中油酸在室溫下容易凝固，不符合自微乳油相的要求；乳化劑在篩選時(shí)同樣吐溫40和吐溫60在室溫條件下容易凝固失去流動(dòng)性，不利于自微乳的制備，并且溶解度在其中也比在吐溫80中小。自微乳的粒徑與其在磁力攪拌器上的攪拌時(shí)間和轉(zhuǎn)速有關(guān)，故試驗(yàn)過(guò)程中固定溫度、轉(zhuǎn)速和時(shí)間等外界條件。通過(guò)偽三元相圖先初步篩選空白自微乳的比例，在此基礎(chǔ)上再利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化含藥自微乳處方，最終由星點(diǎn)設(shè)計(jì)建立的模型出最優(yōu)處方。

3 討論

本試驗(yàn)選擇的乳化劑吐溫80、吐溫60等為非離子型乳化劑，具有高親水親油平衡(HLB11-15)值，小腸上皮細(xì)胞膜的流動(dòng)性可被有效改善，增加了細(xì)胞間的連接從而加速藥物的穿膜滲透，藥物的溶出度和生物利用度因此得到提高。處方中助乳化劑則選擇能與乳化劑相溶的低相對(duì)分子質(zhì)量的醇類如PEG-400、1，2-丙二醇等，除了可以在其他相之外輔助溶解藥物，還可以提高膜的牢固性和界面膜的柔順性流動(dòng)性，調(diào)節(jié)乳化劑的HLB 值，同時(shí)又可減少乳化劑的用量，從而降低自微乳的潛在毒性，有利于藥物最終的臨床應(yīng)用。與傳統(tǒng)乳劑相比，蒲公英根自微乳溶液粒徑更小，能夠使得藥物更加分散，促使藥物更快、更有效地被胃腸道吸收，從而提高生物利用度。偽三元相圖用于空白自微乳的處方篩選，由于其不完全確定性及試驗(yàn)過(guò)程中目測(cè)相變臨界點(diǎn)的人為因素，故可能存在誤差，且處方的覆蓋面可能不夠全面，因此先確定比例選擇各個(gè)相的大致范圍；再利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法進(jìn)一步對(duì)加藥自微乳進(jìn)行處方篩選，此種方法可有效針對(duì)試驗(yàn)建立模型，在有效范圍內(nèi)覆蓋大面積范圍進(jìn)行試驗(yàn)，相較偽三元相圖法篩選處方更加有效準(zhǔn)確。

自微乳給藥系統(tǒng)可增加難溶性藥物的溶解度，口服后其在胃腸蠕動(dòng)作用下快速乳化和高度分散，形成具有巨大表面積的區(qū)域，可有效提高藥物的吸收速率和程度；自微乳給藥系統(tǒng)中的表面活性劑成分可增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，提高膜的通透性而促進(jìn)跨膜吸收；自微乳給藥系統(tǒng)中脂質(zhì)成分如脂肪酸等可提高藥物的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)增加口服吸收，具有廣泛的應(yīng)用前景。