P2X7受體在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義*

吳丹，耿爽，胡軼

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科， 湖北 武漢 430014）

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%[2]。隨著早期診斷和治療方式的改進，NSCLC發(fā)病率有所下降，但5年生存率仍不盡人意[3]。尋找新的預后標志物，對改善NSCLC 預后尤為重要[4-5]。P2X7 受體是由位于12q24.31 位點的P2X7基因編碼的細胞膜外受體蛋白，相對分子質量約為120 kD，屬于P2X 受體家族成員，可由細胞外三磷酸腺苷激活[6-7]。P2X7R 與多種腫瘤遷移、侵襲及預后密切相關[8-9]。在胰腺癌中，P2X7R 表達可調節(jié)癌細胞存活和遷移，采用P2X7R 變構抑制劑可抑制胰腺癌細胞增殖和遷移[10-11]。然而P2X7R 在NSCLC 中的表達及預后鮮見報道且不完全[12-13]。本研究通過免疫組織化學法檢測NSCLC 患者癌組織中 P2X7R 的表達，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月—2014年1月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院行肺癌切除術的118 例患者組織標本。所有病理標本在納入研究前經2 位病理醫(yī)師根據NSCLC 病理分期（TNM 分期第8 版）標準[14]重新確認，共30 例患者接受術前新輔助化學治療（以下簡稱化療）。術后患者均按美國國立綜合癌癥網絡（national comprehensive cancer network, NCCN）指南進行后續(xù)化療，未接受分子靶向治療。納入標準：患者均接受NSCLC 切除術；除NSCLC 外，不存在其他部位的惡性腫瘤；有完整的臨床病歷資料和隨訪信息；按照NCCN 指南原則進行治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集從患者病歷資料中提取臨床病理資料，包括患者性別、年齡、吸煙狀況、腫瘤大小、組織學類型、淋巴結轉移及TNM 分期。

1.2.2 隨訪總生存時間定義為從術后至隨訪截止日或患者死亡時間的間隔。無瘤生存時間定義為從術后到首次隨訪發(fā)現復發(fā)或隨訪截止日的間隔。

1.3 免疫組織化學染色

將甲醛固定、石蠟包埋的病理組織切成4μm 厚切片，隨后將組織切片脫石蠟并在梯度乙醇中脫水。在pH 6.0 的乙二胺四乙酸緩沖液（武漢博士德生物公司）中煮沸3 min 行抗原修復。用3%過氧化氫（武漢博士德生物公司）淬滅內源性過氧化物酶活性30 min。使用P2X7R 單克隆抗體（英國Abcam 公司）在4℃條件下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗（美國Sigma-Aldrich 公司）在37℃條件下孵育2 h，用辣根過氧化物酶和3，3'-二氨基聯苯胺色原溶液（武漢博士德生物公司）處理載玻片并用蘇木精復染。

1.4 免疫組織化學評分

通過評估染色強度和密度來確定免疫組織化學評分：采用陽性細胞百分比結合染色強度對P2X7R表達水平進行評分。染色強度評分：0 分為陰性；1 分為弱陽性；2 分為中度陽性；3 分為強陽性。P2X7R 陽性細胞的百分比評分：1 分為0%～10%；2 分 為＞10% ～50%；3 分 為＞50% ～80%；4 分為＞80%～100%。將兩者得分相乘，計算出總得分，分值從0 ～12 不等?？偟梅帧? 分為P2X7R 低表達；≥4 分為P2X7R 高表達。其中，P2X7R 低表達組46 例，高表達組72 例。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，Cox 比例風險模型用于預后分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達

NSCLC 組織中P2X7R 蛋白陽性染色主要定位于NSCLC 細胞質和細胞膜上，72 例（61.0%）癌組織中P2X7R 呈高表達；46 例（39.0%）癌組織中P2X7R 呈低表達。見圖1。

圖1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達（免疫組織化學染色×400）

2.2 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達率比較

不同性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)、組織學類型、術前新輔助化療及術后化療患者的P2X7R 蛋白高表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而不同TNM 分期及有無淋巴結轉移患者的P2X7R 蛋白高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白表達與預后的關系

Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，P2X7R 高表達組與低表達組無瘤生存率及總生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=5.687 和14.687，均P=0.000），P2X7R 高表達組均低于P2X7R低表達組。P2X7R 高表達組5年無瘤生存率為18.1%，P2X7R 低表達組5年無瘤生存率為25.1%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=9.254，P=0.000），P2X7R 高表達組低于P2X7R 低表達組。P2X7R 高表達組5年總生存率為23.3%，P2X7R 低表達組5年總生存率為30.1%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=13.721，P=0.000），P2X7R 高表達組低于P2X7R 低表達組。見圖2。

表1 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達率比較（n =118）

2.4 影響NSCLC 患者無瘤生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風險模型分析顯示，P2X7R 表達、TNM 分期及淋巴結轉移是影響NSCLC 患者無瘤生存率的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風險模型分析表明，P2X7R 表達及TNM 分期是影響NSCLC 患者無瘤生存率的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

圖2 P2X7R 高、低表達組無瘤生存率和總生存率比較

表2 多因素Cox 比例風險模型分析影響患者無瘤生存率的因素參數

2.5 影響NSCLC 患者總生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風險模型分析顯示，P2X7R 表達、TNM 分期及淋巴結轉移是影響NSCLC 患者總生存率的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風險模型分析表明，P2X7R 表達及TNM 分期是影響NSCLC 患者總生存率的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 多因素Cox 比例風險模型分析影響患者總生存率的因素參數

3 討論

在我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第1 位[15]，相對于西方發(fā)達國家，我國NSCLC 病死率更高，且呈逐年上升趨勢[16-17]。P2X7R 在人體多種細胞中表達，其中以干細胞、神經膠質細胞及內皮細胞表達最為顯著，參與調節(jié)炎癥、細胞增殖和凋亡、代謝及吞噬[18]。

本研究發(fā)現，118 例患者中61.0%的患者P2X7R呈高表達；39.0%患者P2X7R 呈低表達，這與最近報道結果類似[19]。有學者采用免疫組織化學和聚合酶鏈反應檢測94 例結直腸癌中P2X7R 的表達，發(fā)現高表達51 例，低表達43 例，結果顯示在不同腫瘤組織中P2X7R 存在表達差異[19]。本研究結果發(fā)現，NSCLC 組織中的P2X7R 表達水平與TNM 分期和淋巴結轉移相關，而與性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)及組織學類型無關。BOLDRINI 等[13]報道，并未發(fā)現P2X7R 蛋白表達與臨床病理因素有相關性，原因可能與其研究所用的樣本量偏少及病理類型的異質性有關。

有研究報道，NSCLC 的TNM 分期和淋巴結轉移與患者疾病嚴重程度和腫瘤細胞侵襲性密切相關[4]。上述結果顯示，P2X7R 高表達的NSCLC 患者惡性程度更高。通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現，P2X7R高表達的NSCLC 患者預后劣于P2X7R 低表達患者。Cox 比例風險模型分析提示，P2X7R 表達為影響無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素。BOLDRINI 等[12]報道，P2X7R mRNA 的表達與NSCLC 預后相關，P2X7R mRNA 高表達的NSCLC 患者預后不良，與本研究結果類似。有文獻報道，在結直腸癌患者中P2X7R 高表達為影響結直腸癌術后患者總生存率的獨立危險因素[19]。盡管文獻報道在乳腺癌和前列腺癌的動物實驗中均發(fā)現P2X7R 表達增強，但并沒有P2X7R 表達與預后關系的報道[20-22]。

P2X7R 高表達導致NSCLC 臨床預后不佳的機制尚不清楚。其機制可能為：①在體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞系中P2X7R 通過激活三磷酸腺苷參與上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）[20]，而EMT 是NSCLC 發(fā)生、發(fā)展的關鍵步驟[21]，P2X7R 可能通過影響EMT 而影響NSCLC 的進展；②P2X7R高表達可誘導癌細胞侵襲和轉移，在體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系中，P2X7R 高表達或沉默分別促進或抑制乳腺癌細胞增殖能力[22]；③新血管形成是大多數腫瘤進展和轉移的先決條件，在胰腺癌模型中發(fā)現P2X7R高表達可促進胰腺癌細胞中新生血管形成[23-24]，其是否通過促進腫瘤血管生成參與腫瘤進展值得進一步研究。

本研究為單中心的回顧性研究，納入病例數較少，尚需要多中心大樣本研究來證實本研究結論；同時P2X7R 影響NSCLC 患者預后的分子機制尚需要進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現NSCLC 組織中P2X7R高表達與患者惡性臨床病理特征及預后不良相關，P2X7R 高表達是NSCLC 患者預后不良的獨立危險因素。