非小細(xì)胞肺癌中反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA RAB11B-AS1的表達(dá)及臨床意義

汪柳，黃培芝，熊將軍

作者單位：湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院（湖南省直中醫(yī)醫(yī)院）檢驗(yàn)科，湖南 株洲412000

肺癌是最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居全球腫瘤首位，嚴(yán)重危害人類的生命健康［1-2］。肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與環(huán)境污染、吸煙、既往肺部慢性感染、電離輻射和遺傳等因素有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，進(jìn)展期病人5年生存率僅為15%［3］。尋找治療NSCLC的新途徑，探尋有效的基因治療靶點(diǎn)是目前亟須解決的問(wèn)題。全基因組分析顯示，人體內(nèi)超過(guò)90%的基因被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。大量研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮作用，并在多種腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌或促癌作用［4-5］。lncRNA可通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多種途徑調(diào)控基因表達(dá)［6］。反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA RAB11B-AS1（long non-coding RAB11B antisense RNA，lncRNA RAB11B-AS1）是一種反義lncRNA，能通過(guò)不同機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，一些特定的lncRNA在NSCLC中表達(dá)異常，與NSCLC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切聯(lián)系［7］。然而lncRNA RAB11B-AS1在NSCLC中的作用鮮有報(bào)道，本研究將通過(guò)檢測(cè)NSCLC癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，以期為NSCLC的治療和預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年9月至2017年3月于湖南省直中醫(yī)醫(yī)院行手術(shù)治療的97例NSCLS病人，其中男/女：54例/43例，年齡（57.31±9.86）歲，范圍為34～79歲。Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～Ⅳ期：47例/50例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有/無(wú)：60例/37例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有/無(wú)：28例/69例。試驗(yàn)組為病人的癌組織，對(duì)照組則選取同一病人的癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確認(rèn)為NSCLC；②入院前3個(gè)月未行放、化療；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎、心臟等功能不良者；②同時(shí)患有其他惡性腫瘤者；③拒絕參與研究者。

對(duì)所有病人隨訪2年，從術(shù)后第1天起，隨訪日期截至2019年4月1日，無(wú)失訪病例，統(tǒng)計(jì)隨訪期間的生存人數(shù)。97例NSCLC病人中共存活41例，死亡56例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人及其近親屬均知情且同意。

1.2主要儀器與試劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）儀（型號(hào)T100），購(gòu)于伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Titan One Tube RT-PCR試劑盒（貨號(hào)11939823001），購(gòu)于Sigma-Aldrich中國(guó)上?？偛?；Prime Script?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號(hào) RR037A）及TRIzol試劑（貨號(hào)JMS12279），均購(gòu)于日本TaKaRa公司。

1.3研究方法

1.3.1 樣品采集 于術(shù)中收集新鮮的NSCLC癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣大于2 cm），液氮中冷凍后，移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）測(cè)定lncRNA RAB11B-AS1的表達(dá) ①提取總RNA：組織破碎后勻漿，按照Trizol RNA提取說(shuō)明書操作，所得RNA溶于RNase Free水，保證RNA完整，并檢測(cè)RNA純度及濃度。②逆轉(zhuǎn)錄：將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），按照Prime Script? RT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書操作，-20℃保存所得cDNA。③qPCR反應(yīng)（20μL體系）：2×SYBR Green PCR Master Mix（10μL），上下游引物（各1μL），cDNA模板（2μL），水（6μL），各樣本均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參，其正向引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物序列為5’-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3’；lncRNA RAB11B-AS1正向引物序列為5’-CCATGGACCCTTGCGAGAT-3’，反向引物序列為 5’-CAAAGTCCATGTAAACATGTTCCC-3’。④反應(yīng)條件：于T100 qPCR儀上進(jìn)行，95℃30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA RAB11B-AS1相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0分析，計(jì)量資料以xˉ±s表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier曲線繪制NSCLC病人術(shù)后24個(gè)月的生存曲線；影響NSCLC預(yù)后的危險(xiǎn)因素采用Cox多因素回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR法測(cè)定組織中l(wèi)ncRNA RAB11BAS1表達(dá)量試驗(yàn)組lncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)量為（2.61±0.74），對(duì)照組lncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)量為（1.35±0.41），試驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝14.669，P＜0.001）。

2.2癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1表達(dá)與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系以lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)的平均數(shù)值（2.61）將試驗(yàn)組分為高、低表達(dá)組。lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)與病人年齡、性別、吸煙史及腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P＞0.05），與病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病分期有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

2.3癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1表達(dá)與NSCLC病人預(yù)后的關(guān)系繪制97例NSCLC病人術(shù)后1～24個(gè)月的生存曲線，其中生存41例，總生存率為42.27%（41/97）。lncRNA RAB11B-AS1高表達(dá)組術(shù)后 2年總生存率為 28.30%（15/53），95%CI：13.401～17.542；低表達(dá)組術(shù)后2年總生存率為59.09%（26/44），95%CI：17.595～21.451，兩組比較log-rank值為9.272，P＝0.002。見圖1。

圖1 非小細(xì)胞肺癌97例癌組織反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA RAB11B-AS1表達(dá)24個(gè)月生存曲線

2.4影響NSCLC病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析單因素分析顯示，病理類型、分化程度、疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響NSCLC病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病分期（HR＝2.69、2.70、2.93，95%CI：1.83～3.96、1.58～4.62、1.67～5.13，均P＜0.05）均是影響NSCLC病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

3 討論

NSCLC多數(shù)病人確診時(shí)處于NSCLC晚期［8］。晚期NSCLC病人常伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，療效不佳［9］。隨著科技的進(jìn)步和分子生物技術(shù)的發(fā)展，NSCLC分子靶向治療取得一定進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前仍缺乏有效的診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)［10］。

lncRNA不具有編碼蛋白功能，但可以參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，在人體內(nèi)發(fā)揮重要作用。lncRNA主要通過(guò)以下途徑參與細(xì)胞調(diào)控：①影響目的基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄；②影響RNA聚合酶Ⅱ活性；③與目的基因轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈；④與目的蛋白結(jié)合影響其活性；⑤改變目的蛋白在細(xì)胞中的定位［11］。越來(lái)越多研究表明，lncRNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［12-13］。Meng等［14］發(fā)現(xiàn)，lncRNA RMRP在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)546、SPC-A1、H1299和H23中均呈高表達(dá)，且其異常表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌癌細(xì)胞增殖和侵襲。She等［15］研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG7可增強(qiáng)Fas凋亡抑制分子2（FAIM2）蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。

表2 非小細(xì)胞肺癌病人97例的預(yù)后影響因素分析

根據(jù)位置及轉(zhuǎn)錄方向，可將lncRNA分為5類：雙向、正義、反義、基因間和內(nèi)含子lncRNA［16］。反義lncRNA含有m7GPPPN結(jié)構(gòu)，可躲避5’-3’核酸外切酶，比其他lncRNA更穩(wěn)定，并且反義lncRNA亞細(xì)胞定位相對(duì)自由，其發(fā)揮作用的機(jī)制更加廣泛［17］。反義lncRNA正在受到人們的廣泛關(guān)注。Wu等［18］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5-AS1在NSCLC癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與疾病分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，lncRNA GAS5-AS1過(guò)表達(dá)能夠抑制NSCLC細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抑癌作用。lncRNA RAB11BAS1是RAS癌基因家族成員，定位于19q13.2處，長(zhǎng)1 022 bp，有3個(gè)外顯子。馮麗萍等［19］研究表明，胃癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1表達(dá)上調(diào)，且與病人預(yù)后密切相關(guān)。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)，lncRNA RAB11BAS1在骨肉瘤中組織中表達(dá)下調(diào)，能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。目前，對(duì)于lncRNA RAB11B-AS1在腫瘤疾病中的作用研究較少，在NSCLC中的表達(dá)情況及作用未見報(bào)道。

本研究檢查NSCLC病人癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)在癌組織中明顯高于癌旁組織，NSCLC病人癌組織中腺癌、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期病人lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)水平明顯高于鱗癌及其他、中高分化、無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期病人，提示lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)可能影響NSCLC的發(fā)生及病程進(jìn)展；Kaplan-Meier曲線顯示，lncRNA RAB11B-AS1高表達(dá)組的生存率（28.30%）低于低表達(dá)組（59.09%），提示lncRNA RAB11B-AS1高表達(dá)影響NSCLC病人術(shù)后生存率；Cox回歸分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)、處轉(zhuǎn)移和疾病分期均是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示下調(diào)lncRNA RAB11B-AS1可能對(duì)提高NSCLC病人的術(shù)后生存率有一定幫助。

綜上所述，lncRNA RAB11B-AS1在NSCLC病人癌組織中上調(diào)，其表達(dá)與病人臨床病例特征有關(guān)，且與NSCLC病人的預(yù)后密切相關(guān)，可為NSCLC的治療提供參考。