一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定保肝丸中4個(gè)指標(biāo)性成分的含量

任瑩，呂曉軍，李德林，王虎

作者單位：太和縣中醫(yī)院制劑室，安徽 阜陽236600

保肝丸是太和縣中醫(yī)院國家級(jí)重點(diǎn)科室肝病科臨床應(yīng)用多年的專用方，主要由黨參、白芍、大黃等中藥組成。保肝丸作為療效顯著且臨床應(yīng)用多年的醫(yī)院傳統(tǒng)中藥制劑，亟須建立完善的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)方法，為該制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究于2018年6—12月以對(duì)照品便宜易得的黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，建立保肝丸中主要藥味的指標(biāo)性成分芍藥苷、五味子醇甲、大黃素含量的QAMS，以期為保肝丸的質(zhì)量控制提供更全面可靠的依據(jù)，進(jìn)而保證制劑質(zhì)量，確保臨床療效。

1 儀器與試劑

UltiMate3000高效液相色譜儀［二極管陣列檢測(cè)器（DAD），賽默飛世爾科技有限公司］；Agilent1220型高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司）；XP205DR型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），萬能粉碎機(jī)（上海賀帆儀器有限公司）。

對(duì)照品黃芩苷（110715-201720），芍藥苷（110736-201640），五味子醇甲（110857-201714），大黃素（110756-201512）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇，均為色譜純，美國天地公司；磷酸，分析純，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；哇哈哈純凈水。

保肝丸為太和縣中醫(yī)院中藥制劑室生產(chǎn)，批號(hào)分別為 20170826、20171012、20171221、20180127、20180306、20180509。缺味陰性樣品均由中藥制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.683 1、0.442 1、0.374 5、0.368 1 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容制成6個(gè)質(zhì)量濃度不同的混合對(duì)照品溶液，分別編號(hào)1、2、3、4、5、6。

2.1.2 供試品溶液的制備 取保肝丸適量，粉碎，過四號(hào)篩，精密稱取約1 g，加甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

現(xiàn)在司乘人員只需用手機(jī)掃描二維碼，即可完成路政賠補(bǔ)償款支付，這不僅有效解決了司乘人員因現(xiàn)金零錢不足而不能支付的燃眉之急。同時(shí)也減少了基層工作人員辨別真?zhèn)魏椭脫Q零錢的工作量。節(jié)省了雙方時(shí)間，也大大提高了工作效率和工作質(zhì)量。

2.1.3 保肝丸缺白芍溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺白芍的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備缺白芍陰性供試液。

2.1.4 保肝丸缺黃芩溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺黃芩的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備缺黃芩陰性供試液。

2.1.5 保肝丸缺五味子溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺五味子的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備缺五味子陰性供試液。

2.1.6 保肝丸缺大黃溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺大黃的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備缺大黃陰性供試液。

2.2色譜條件UltiMate3000高效液相色譜儀，依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈和0.01%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間及比例見表1，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，分段變波長(zhǎng)測(cè)定0～25 min，230 nm、＞25～50 min，280 nm，＞50～90 min，254 nm。

表1 UltiMate3000高效液相色譜儀梯度洗脫時(shí)間表

2.3方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 按“2.2”色譜條件，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、各缺味陰性對(duì)照溶液，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，各陰性對(duì)照均無干擾（圖1），說明該方法專屬性較好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液各5μL，注入高效液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，具體見表2。

表2 混合對(duì)照品溶液4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取保肝丸樣品（批號(hào)20180127），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的峰面積，計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.34%、0.62%、0.21%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取保肝丸樣品（批號(hào)20180127），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄各色譜峰的峰面積。計(jì)算結(jié)果顯示芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均含量分別為1.708、1.106、0.935、0.921 mg/g，RSD分別為1.02%、0.87%、1.16%、0.68%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取保肝丸樣品（批號(hào)20180127），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄各色譜峰的峰面積。計(jì)算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素峰面積的RSD分別為0.65%、0.79%、1.04%、0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取保肝丸樣品（批號(hào)20180127）6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入一定量對(duì)照品溶液，使樣品中待測(cè)成分量與對(duì)照品加入量大致相等，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣并記錄各色譜峰的峰面積。計(jì)算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均加樣回收率分別為98.65%、101.23%、99.32%、97.58%，RSD分別為1.26%、1.04%、1.35%、1.13%。表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.4相對(duì)校正因子的確定

2.4.1 相對(duì)校正因子的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)校正法［1］，取“2.1.1”項(xiàng)下制備的系列混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5μL，記錄各對(duì)照品色譜峰面積，按照公式fk/m＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）（式中Ak為內(nèi)參物的峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度；Am為待測(cè)物的峰面積，Am為待測(cè)物的質(zhì)量或濃度），以黃芩苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算芍藥苷、五味子醇甲、大黃素的相對(duì)校正因子［9］，結(jié)果見表3。

表3 指標(biāo)性成分的相對(duì)校正因子

2.4.2 不同儀器和色譜柱對(duì)校正因子的影響 分別采用賽默飛UltiMate3000、Agilent1220型高效液相色譜儀；依次利用依利特Hypersil ODS2、Thermo Syncrois C18、Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，取系列對(duì)照品進(jìn)樣檢測(cè)，按照“2.4.1”項(xiàng)下公式，計(jì)算各成分的相對(duì)校正因子，考察不同色譜儀器和色譜柱對(duì)各待測(cè)成分的相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，5。結(jié)果表明不同儀器和不同色譜柱對(duì)各成分的相對(duì)校正因子無明顯影響。

表4 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表5 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.5樣品測(cè)定及準(zhǔn)確性驗(yàn)證分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法（QAMS）測(cè)定6批保肝丸中4種指標(biāo)性成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的含量，并將兩種方法的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明外標(biāo)法和本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法所得結(jié)果無明顯差異，各待測(cè)成分的相對(duì)校正因子可靠，該一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確度較高。見表6。

3 討論

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，中藥的多種活性成分是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此多成分的質(zhì)控模式已成為中藥質(zhì)量控制的重點(diǎn)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的4種成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素是處方中主要指標(biāo)性成分。研究表明黃芩苷能改善炎癥及肝細(xì)胞凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷程度，且效果與黃芩苷用量相關(guān)［13］，另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明黃芩苷對(duì)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展具有抑制作用［14］；芍藥苷能抑制肝損傷中炎性因子的產(chǎn)生，提高肝組織中膽鹽輸出泵（BSEP）和多藥耐藥蛋白（MRP2）的表達(dá)［15-16］；五味子醇甲能抗氧化、對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用［17］；大黃素能降低肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕肝細(xì)胞損傷程度［18］，對(duì)膽汁淤積引起的肝損傷具有保護(hù)作用［19］。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的4種指標(biāo)性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大，為能夠同時(shí)分離檢測(cè)4種成分，對(duì)各實(shí)驗(yàn)條件及參數(shù)進(jìn)行了反復(fù)摸索。首先采用單因素變量法考察了提取條件，包括提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間，優(yōu)選出25倍甲醇超聲處理30 min。其次，流動(dòng)相方面選擇洗脫能力較強(qiáng)的乙腈和0.1%磷酸水溶液，各個(gè)目標(biāo)峰均能達(dá)到較好的分離度且峰型較好。最后檢測(cè)波長(zhǎng)考察，根據(jù)4種成分的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，選擇分段檢測(cè)，即230 nm檢測(cè)芍藥苷，280 nm檢測(cè)黃芩苷，254 nm檢測(cè)五味子醇甲和大黃素。

該實(shí)驗(yàn)利用梯度洗脫的方法使4種成分均能達(dá)到較高的分離度，并通過專屬性實(shí)驗(yàn)證明各成分的含量測(cè)定均無干擾；選擇DAD檢測(cè)器進(jìn)行分波段檢測(cè)，雖然化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大，各成分仍能有較高的信號(hào)相應(yīng)，精密度較高；同時(shí)線性關(guān)系考察結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)各成分的峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系；加樣回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示含量測(cè)定的準(zhǔn)確度較高。以上試驗(yàn)作為該方法的前期方法學(xué)考察，顯示了該方法在分離檢測(cè)上的準(zhǔn)確性和可靠性，為下一步的數(shù)學(xué)模式分析奠定基礎(chǔ)。QAMS是以一種組分為內(nèi)參，通過建立其與其他待測(cè)成分的相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照品同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)成分的目的。故相對(duì)校正因子是影響QAMS的準(zhǔn)確度的決定性因素，而實(shí)際運(yùn)用中，待測(cè)組分的濃度及色譜系統(tǒng)因素均會(huì)對(duì)相對(duì)校正因子產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)在充分考慮濃度因素的情況下，運(yùn)用多點(diǎn)校正法［1］計(jì)算相對(duì)校正因子；并進(jìn)一步重點(diǎn)考察了不同色譜儀、不同色譜柱的相對(duì)校正因子，結(jié)果顯示RSD均小于2%，表明該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性較好。最后，通過比較外標(biāo)法和QAMS的測(cè)定結(jié)果，兩種方法無明顯差異，說明各待測(cè)成分的相對(duì)校正因子可靠，該QAMS準(zhǔn)確度較高。

表64 種指標(biāo)性成分外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法（QAMS）定量測(cè)定結(jié)果/（mg/g）

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立了以黃芩苷為對(duì)照品，同時(shí)測(cè)定保肝丸中芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素4種指標(biāo)性成分的方法，與常規(guī)的一測(cè)一評(píng)法比較大大降低了質(zhì)控的成本，縮短了檢測(cè)周期，經(jīng)驗(yàn)證該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，為保肝丸的全面質(zhì)量控制提供了更為便捷經(jīng)濟(jì)的途徑。