基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的分子機制

龐靜雯，王丹慧，徐梅月，張艷春，2，張祖志

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2. 中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

糖尿病歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，其病機為陰液虧損、燥熱偏勝[1]，臨床癥狀有多飲、多食、尿甜、體瘦等。白虎加人參湯[2]、葛根芩連湯等可以治療糖尿病。白虎加人參湯能夠用于津氣兩傷、身熱而渴、出汗、惡寒、煩渴、多尿等癥狀的治療[3]。葛根芩連湯可以生津養(yǎng)液，改善消渴癥狀[4]。

丹蛭降糖膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院方朝暉研制的中藥制劑，由太子參、水蛭、牡丹皮、澤瀉、生地黃、菟絲子組成，臨床用于改善胰島素抵抗，預(yù)防和治療糖尿病及并發(fā)癥[5]。研究表明：太子參多糖具有很好的緩解胰島素抵抗的作用[6]；生地黃中萜類和多糖都具有降低血糖的功效[7-8]；丹皮酚具有抗炎、降低血糖等功效；牡丹皮和菟絲子中含有槲皮素，具有抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用；澤瀉中萜類提取物能夠發(fā)揮治療糖尿病的作用[9]；水蛭的主要成分水蛭素具有凝血的功能[10]，可以發(fā)揮治療糖尿病血管病變作用[11-12]。現(xiàn)有報道指出，丹蛭降糖膠囊治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用機制可能與調(diào)節(jié)VEGF/Akt/eNOS信號通路[13]，激活TGF-β1/Smad3信號通路[14]，調(diào)控mTOR/S6K1信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬[15]等有關(guān)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的分子機制，為該方的臨床藥理學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中國中藥整合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database andanalysis platform，TCMID)分別檢索太子參、澤瀉、牡丹皮、菟絲子、水蛭、生地黃的化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件[1]獲得主要有效活性成分化合物。同時，在TCMID中，獲取水蛭、生地黃對應(yīng)活性成分及SMILE碼。再利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Uniprot數(shù)據(jù)庫)和Swiss Targets Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)獲取活性成分的靶蛋白基因信息。

1.2 糖尿病相關(guān)靶點的獲取 以“diabetes”為關(guān)鍵詞，在人類基因庫(GeneCards)中檢索獲得有關(guān)糖尿病的靶標(biāo)基因。

1.3 活性成分-糖尿病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為明確“丹蛭降糖膠囊”與糖尿病潛在靶點間的相互作用，將丹蛭降糖膠囊活性成分對應(yīng)的靶點與糖尿病靶標(biāo)基因?qū)隫enny網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，繪制交集基因的韋恩圖。運用Cytoscape 3.7.2軟件，通過Tools模塊內(nèi)“Network Analyzer”模塊進(jìn)行分析，構(gòu)建其活性成分-糖尿病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)的構(gòu)建 利用蛋白互作平臺數(shù)據(jù)庫(STRING)分析篩選得到的疾病-藥物成分共同靶蛋白信息，獲得相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2分析并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 靶點的通路和基因本體(gene ontology，GO)分析 借助ClusterProfiler R軟件，對丹蛭降糖膠囊的活性成分作用靶點進(jìn)行GO分析，以了解靶點主要的作用過程；再進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的代謝通路富集分析，以了解靶點在通路中分布情況。獲取丹蛭降糖膠囊治療糖尿病涉及的關(guān)鍵生物學(xué)過程及關(guān)鍵信號通路。

2 結(jié)果

2.1 丹蛭降糖膠囊活性成分篩選 從TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中，共獲得丹蛭降糖膠囊活性化合物48個，其中菟絲子12個，澤瀉10個，牡丹皮11個，太子參8個，水蛭3個，生地黃8個。見表1。

2.2 糖尿病靶點獲取與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助GeneCards檢索“diabetes”，共獲得564個糖尿病候選靶點。

2.3 交集靶標(biāo)篩選結(jié)果 繪制244個活性化合物對應(yīng)靶點與糖尿病對應(yīng)的564個靶點的韋恩圖，最終獲取共有基因靶點77個，共得到對應(yīng)丹蛭降糖膠囊的活性成分25個。

表1 丹蛭降糖膠囊活性成分表

續(xù)表1

2.4 活性成分-糖尿病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件，將丹蛭降糖膠囊的活性成分與糖尿病作用靶標(biāo)一一映射，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。網(wǎng)絡(luò)圖中，包含節(jié)點108個(靶基因數(shù)量77個，活性成分?jǐn)?shù)量25個，藥物數(shù)量6個，邊351條)。利用“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)圖中相關(guān)性進(jìn)行分析，Degree最高的是槲皮素(quercetin)，其次是山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、異鼠李素(isorhamnetin)、刺槐素(acacetin)等，Degree越高，表示化合物與糖尿病的相關(guān)性越大，提示以上化合物在影響糖尿病中發(fā)揮重要作用。見表2。

表2 丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的關(guān)鍵化合物信息

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果 將預(yù)測的77個作用靶點導(dǎo)入STRING獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，設(shè)置最低相互作用評分為中等置信度0.4，刪除孤立點IER3IP，得到76個預(yù)測靶標(biāo)。再次借助Cytoscape 3.7.2軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，PPI網(wǎng)絡(luò)圖包括76個節(jié)點，2 258條邊，平均Degree值為29.7。Degree數(shù)值越大，節(jié)點大小越大，對應(yīng)重要程度越高。取Degree值前30位作為核心基因，根據(jù)Degree值排序，排名前列的分別是白細(xì)胞介素-6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等，制作柱形圖(圖2)。

2.6 GO功能分析結(jié)果 對76個共有靶點進(jìn)行GO功能分析，共獲得生物學(xué)過程1 702個，主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、小分子代謝過程的調(diào)控、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、氧含量反應(yīng)、缺氧反應(yīng)；細(xì)胞組成27個，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；分子功能87個，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、細(xì)胞因子活性、磷酸酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、絲氨酸水解酶活性等。根據(jù)P大小，利用R語言繪制氣泡圖，列舉排在前列的條目，見圖3。

2.7 KEGG富集通路分析結(jié)果 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，76個交集基因富集在149條通路上，按照顯著性排序，取排名前20的富集條目繪制條形圖(圖4)。

結(jié)果表明，化合物作用的靶點主要涉及糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、Toll樣受體信號通路、甲型流感等。

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的核心基因

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法，構(gòu)建了靶點和疾病的網(wǎng)絡(luò)模型并進(jìn)行通路富集分析，系統(tǒng)探索丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的可能活性成分及潛在分子機制。

3.1 可能關(guān)鍵成分的藥理作用 本研究表明，丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的關(guān)鍵成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素、β-谷甾醇等。已有研究證實：槲皮素能夠提高成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)水平，從而激活下游關(guān)鍵激酶腺苷酸依賴的蛋白激酶(AMPK)，從而改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[16]。槲皮素還可以抑制p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)，降低下游NF-κB表達(dá)，從而減少IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌，發(fā)揮抗炎的作用[17]。木犀草素可以激活脂肪細(xì)胞中AMPK和PPARγ，從而提高胰島素敏感性[18]。木犀草素可以減少小腸吸收碳水化合物，降低餐后血糖。木樨草素可以降低糖尿病期間Wnt/β-catenin信號通路的抑制，達(dá)到改善胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂的目的[19-20]。β-谷甾醇的功能包括抗炎、抗腫瘤、中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)等，但是未見糖尿病治療作用報道。

綜上，推測槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇為丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的關(guān)鍵化合物，而刺槐素可作為潛在化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，已有研究指出，丹皮酚、太子參多糖、生地黃多糖、澤瀉中萜類均具有降低血糖的作用，但是在該方中，是否為降低血糖的主要成分有待進(jìn)一步實驗證實。

注：圓點越大代表富集基因數(shù)目越多，顏色越紅代表P值越小

圖4 KEGG富集分析柱狀圖

3.2 潛在作用機制分析 PPI網(wǎng)絡(luò)圖和GO功能分析展示了丹蛭降糖膠囊與糖尿病關(guān)系密切的靶標(biāo)。丹蛭降糖膠囊治療糖尿病的協(xié)同作用，表現(xiàn)在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子分泌，激活血管新生的相關(guān)靶點[血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，與胰島素信號通路相關(guān)的GAPDH、Akt1]，抑制與氧化應(yīng)激有關(guān)的原癌基因JUN、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14等。KEGG富集信號通路提示該復(fù)方治療糖尿病的主要潛在的信號通路。例如，AGE-RAGE通路能夠?qū)е乱葝u細(xì)胞受損和凋亡[21-22]，造成胰島素的分泌下降，同時該通路還與糖尿病的慢性并發(fā)癥有關(guān)。AGEs與受體結(jié)合后，下調(diào)多條信號通路，如PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[23]，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)因子如TNF-α、IL-6、IL-8引起糖尿病相關(guān)病變。同時，前期研究證實：丹蛭降糖膠囊可以抑制高糖誘導(dǎo)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路過度表達(dá)[24]；抑制mTOR/S6K1信號通路，進(jìn)而提高足細(xì)胞的自噬活性[15]；也可以激活糖尿病血管病變狀態(tài)下被抑制的VEGF/Akt/eNOS及Ang/Tie2信號通路，促進(jìn)血管基底膜的解離，為血管新生的啟動做準(zhǔn)備等[25-26]。這些實驗結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)虛擬篩選結(jié)果基本吻合。

綜上，丹蛭降糖膠囊中發(fā)揮作用的主要成分包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素、刺槐素、β-谷甾醇等。綜合文獻(xiàn)，未見刺槐素直接治療糖尿病的相關(guān)報道，但有研究[27]表明剌槐素能通過降低NF-κB通路的活化水平，抑制TNF-α誘導(dǎo)MCP-1及其mRNA分泌從而發(fā)揮抗炎作用。由此推斷刺槐素可能通過抗炎作用，發(fā)揮對器官的保護(hù)作用。

水蛭是本復(fù)方中較為特殊的藥材，但是本研究結(jié)果中，重要化學(xué)成分中未見與水蛭相關(guān)的化學(xué)成分。這可能是因為水蛭素具有活血化瘀的功效，對糖尿病并發(fā)的血管內(nèi)皮損傷具有修復(fù)作用。但是由于在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析時，以糖尿病的發(fā)病機制為出發(fā)點，所以篩選結(jié)果中，水蛭素不作為發(fā)揮活性的關(guān)鍵化合物。由此推測水蛭素作用機制可能與血小板活化信號通路、Ras等信號通路有關(guān)，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，以調(diào)節(jié)傷口愈合、血液凝固、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等生物過程，從而預(yù)防高血糖對肝臟造成的損傷。

由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍存在局限性，數(shù)據(jù)庫信息有限，后期仍要通過實驗研究進(jìn)行系統(tǒng)的藥理學(xué)驗證。本次研究為今后深入研究其機制提供了理論基礎(chǔ)。