源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體與器官移植

孫東，宋紅麗，沈中陽（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3009）

器官移植是20 世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展中最引人注目的成果之一，在本世紀(jì)又得到更快速的發(fā)展與更廣闊的應(yīng)用［1］。然而目前學(xué)科面臨的如器官移植后免疫排斥反應(yīng)、功能損傷等主要問題至今仍未得到滿意的解決，是目前臨床上桎梏器官移植學(xué)科發(fā)展的重要障礙。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群具有自我更新能力、多向分化潛能的干細(xì)胞。其易于獲得、來源豐富，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)、減輕組織器官損傷、促進(jìn)組織修復(fù)、誘導(dǎo)新生血管生成等多方面生理學(xué)功能，是器官移植領(lǐng)域應(yīng)用干細(xì)胞治療的理想“種子細(xì)胞”［2］。但目前臨床應(yīng)用MSC 面臨著如細(xì)胞來源與種類、干預(yù)的劑量、途徑以及時(shí)機(jī)等方案的選擇、移植后的安全性等諸多問題，制約了其臨床應(yīng)用。外泌體是MSC分泌的細(xì)胞介質(zhì)，其發(fā)現(xiàn)不僅加深了對MSC 作用機(jī)制的認(rèn)識，同時(shí)也為臨床應(yīng)用MSC 細(xì)胞治療的方案提供了更為廣闊的視野。我們對目前已經(jīng)闡明的有關(guān)MSC 來源外泌體在不同細(xì)胞、組織、器官及系統(tǒng)水平上發(fā)揮調(diào)控功能的相關(guān)研究及其機(jī)制進(jìn)行綜述，旨在引起器官移植學(xué)者對MSC 來源外泌體的重視，為干細(xì)胞治療在器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的觀點(diǎn)及思路。

1 MSC 及其釋放的外泌體

MSC 具有趨向于受傷部位進(jìn)行組織修復(fù)、傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)等功能，具有免疫豁免的特權(quán)，這是其在器官移植領(lǐng)域備受矚目的主要原因之 一［3］。但是直接將MSC 作為干細(xì)胞治療的工具仍然面臨著眾多風(fēng)險(xiǎn)。MSC 發(fā)揮功能主要依賴其旁分泌功能實(shí)現(xiàn)，而非通過定向分化形成新的細(xì)胞，其證據(jù)是目前MSC 移植后存活率及存活時(shí)間均有限，但其治療效果卻可以長期存在［4］。MSC 的旁分泌作用不僅局限于直接釋放細(xì)胞因子，同樣依賴于其釋放的外泌體。外泌體中可以包含MSC 等細(xì)胞的蛋白質(zhì)、DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（MicroRNA，MiR）等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多種具有生物學(xué)功能或信息傳遞功能的生物分子，是MSC 發(fā)揮作用的關(guān)鍵作用機(jī)制［5-6］。

2 MSC 外泌體作用的分子機(jī)制概述

外泌體作為細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊的介質(zhì)成分，以旁分泌、遠(yuǎn)距分泌的形式在細(xì)胞間傳播生物信息，在生理及病理狀態(tài)下發(fā)揮重要的調(diào)控作用［7］。MSC 外泌體內(nèi)具有生物學(xué)活性的分子，如蛋白質(zhì)、DNA、RNA 等成分與含量并非是作為一個(gè)特定靜止的群體存在，而是會隨著與細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)環(huán)境、提取純化步驟、細(xì)胞來源等多種條件的改變而呈動態(tài)變化。

非編碼RNA 在體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。一般根據(jù)序列長度將MSC 外泌體中的非編碼RNA 大致分為MiR 和長非編碼RNA（long-nocoding RNA，LncRNA）。外泌體的體積極小，序列較長的核酸及氨基酸組裝成蛋白等往往難以完整保存，而MiR 因其長度多維持在20 ～24 個(gè)核酸之間，在外泌體中更有可能以完整的形式保存下來。因此，在MSC 外泌體的相關(guān)機(jī)制研究多圍繞MiR 進(jìn)行。據(jù)估計(jì)，MiR 參與調(diào)節(jié)的編碼mRNA 翻譯成的蛋白質(zhì)約占30%左右，構(gòu)成了真核生物轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)。MiR 的以組織特異性方式表達(dá)，精確并積極地調(diào)節(jié)參與到細(xì)胞的各個(gè)過程，其經(jīng)典調(diào)控機(jī)制為其在mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)其基因表達(dá)水平，從而控制與細(xì)胞的發(fā)育、分化與其他相關(guān)的細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞途 徑［8］。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，MSC 外泌體中含有種類繁多的非編碼RNA 在促進(jìn)愈合與修復(fù)等多種作用效果中發(fā)揮著重要的調(diào)控機(jī)制。

2.1 調(diào)控干細(xì)胞多能性、分化特性：干細(xì)胞的分化和譜系決定依賴于遺傳物質(zhì)與分化細(xì)胞之間的雙向相互交流與溝通，受到細(xì)胞周期轉(zhuǎn)運(yùn)與環(huán)境刺激的限制。干細(xì)胞來源的外泌體攜帶的遺傳信息［9］。在其中，MSC 外泌體介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的交流與交換是干細(xì)胞生物學(xué)信息交換的重要機(jī)制，維持并促進(jìn)了這種遺傳物質(zhì)的雙向交換，對于維持干細(xì)胞本身的正常生理功能，維持細(xì)胞存活，調(diào)控胚胎及胚胎干細(xì)胞多能性、自我更新性與分化性能的平衡，并且在最終分化譜系的決定方面起著重要作用。例如，經(jīng)MiR-486 修飾的干細(xì)胞外泌體可以將遺傳信息攜帶至紅白血病細(xì)胞中，使靶細(xì)胞內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1 基因表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)其向紅細(xì)胞分化［10］。胚胎干細(xì)胞的外泌體同樣可以將MicroRNA 及其他轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的mRNA 傳遞至靶細(xì)胞中，開啟早期的向視網(wǎng)膜方向的分化程序［11］。MSC 的分化潛能遠(yuǎn)低于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPScell），且移植入體內(nèi)后其分化潛能及自我更新的能力明顯減弱。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為MSC 發(fā)揮作用的方式更多依賴其免疫調(diào)節(jié)作用，而缺乏另一種重要的修復(fù)途徑，即通過分化為特定細(xì)胞組織發(fā)揮修復(fù)損傷的作用，這很大程度上限制了MSC 的修復(fù)潛能。MSC 外泌體對干細(xì)胞多能性的調(diào)控作用或許可以從某一角度加深對MSC 分化潛能的理解，對維持MSC 的干性及調(diào)控其分化方向具有一定的意義［12］。

2.2 修復(fù)靶細(xì)胞器官組織：器官移植后，不可避免地出現(xiàn)移植器官的結(jié)構(gòu)功能損傷。MSC 外泌體具有組織再生與器官保護(hù)等多項(xiàng)生物學(xué)作用。研究表明，MSC 及其來源的外泌體修復(fù)靶器官的作用圍繞著多種機(jī)制，如調(diào)控靶細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等［13］。

2.2.1 優(yōu)化基質(zhì)成分并抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化：基質(zhì)中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與激活是修復(fù)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MSC 外泌體可以激活基質(zhì)中成纖維細(xì)胞合成膠原以優(yōu)化基質(zhì)成分，支持組織的修復(fù)與愈合。該過程的作用機(jī)制通過MSC 外泌體將攜帶的MiR-125a 傳遞至內(nèi)皮細(xì)胞，通過下調(diào)血管生成抑制δ因子樣4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管生成［14］。此外，MSC 外泌體在傷口愈合期間通過抑制周邊細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子蛋白-β/SMAD 家族蛋白2（TGF-β/SMAD2）通路，抑制其向肌成纖維細(xì)胞方向分化，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及成纖維細(xì)胞活化［15］。

MSC 外泌體不僅調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖與活化同時(shí)還可以抑制其上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程。成纖維細(xì)胞增殖可以促進(jìn)基質(zhì)重塑有助于組織修復(fù)，但是過量的成纖維細(xì)胞可能會導(dǎo)致組織增厚反而出現(xiàn)抑制修復(fù)過程的現(xiàn)象［16］。研究表明，使用MSC外泌體可以有效抑制TGF-β 處理過的近端腎小管上細(xì)胞E-鈣粘蛋白的表達(dá)，緩解EMT 現(xiàn)象，從而有效保護(hù)腎臟功能［17］。在體內(nèi)，骨髓MSC 外泌體同樣可以抑制EMT 從而發(fā)揮修復(fù)作用，且在年輕腎臟中比老年腎臟中明顯活躍，提示MSC 外泌體具有潛在的修復(fù)衰老腎臟纖維化的作用［18］。

2.2.2 抑制靶細(xì)胞組織凋亡：MSC 外泌體具有抑制靶細(xì)胞凋亡，促進(jìn)靶細(xì)胞存活從而改善器官功能。例如，單獨(dú)使用MSC 產(chǎn)生的外泌體可以將抗凋亡的MicroRNA 傳遞至受損的心肌細(xì)胞，繼而在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，從而抑制受損心肌細(xì)胞中的促凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活，增強(qiáng)血管生成，最終改善心肌細(xì)胞的功能，且其保護(hù)作用甚至優(yōu)于直接應(yīng)用MSC 進(jìn)行細(xì)胞治療［19］。Wang 等［20］人進(jìn)一步對不同MSC，如來源于骨髓內(nèi)容物的MSC、來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived-MSC，AD-MSC）、來源于子宮內(nèi)膜的間充質(zhì)干細(xì)胞（endometrial MSC， EnMSC）對心臟的保護(hù)作用進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示EnMSC 修復(fù)效果顯著優(yōu)于其他兩種細(xì)胞，其原因在于EnMSC 外泌體中高表達(dá)的MiR-21 可能是其發(fā)揮抑制靶細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子。MiR-181-5p 修飾的AD-MSC 通過外泌介導(dǎo)轉(zhuǎn)移至受損的肝細(xì)胞，激活肝細(xì)胞內(nèi)的自噬系統(tǒng)并下調(diào)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3、B 淋巴細(xì)胞瘤-2、纖粘蛋白、膠原蛋白Ⅰ、波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白等分子表現(xiàn)出肝臟保護(hù)作用［21］?？傊琈SC 外泌體可以通過MicroRNA 傳遞遺傳信息是MSC 發(fā)揮抑制凋亡的修復(fù)作用的重要機(jī)制之一。

2.2.3 促進(jìn)靶細(xì)胞增殖：MSC 外泌體可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)組織再生［22］。動物實(shí)驗(yàn)表明，來源自人滑膜MSC 的外泌體中豐富的MiR-140-5p 能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞的成脂肪方向/成骨方向的平衡，通過上調(diào)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）/Wnt 通路，阻斷基質(zhì)成分分泌，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞向軟骨組織轉(zhuǎn)化，有效預(yù)防大鼠膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［23］。MiR-126是參與心肌細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑、支持心肌組織耐受缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵分子，而經(jīng)葡萄糖處理過的MSC，其釋放的外泌體中MiR-126 顯著降低［24］。這不但解釋了高糖條件或糖尿病患者體內(nèi)MSC 修復(fù)血管內(nèi)皮能力的降低，同時(shí)闡釋了糖尿病患者冠心病發(fā)病率高、預(yù)后差的部分原因［25］。在常規(guī)治療很難干預(yù)的神經(jīng)組織中，MSC 外泌體中的MicroRNA 傳遞至神經(jīng)細(xì)胞后也可以表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)功能以及促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。AD-MSC 外泌體中的LncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄-1 通過調(diào)節(jié)蛋白激酶Cδ Ⅱ剪接促進(jìn)神經(jīng)再生和增強(qiáng)的神經(jīng)元存活［26］。更為有趣的是，衰老小鼠的下丘腦中干細(xì)胞、祖細(xì)胞大量喪失，而補(bǔ)充了年輕健康小鼠下丘腦中的干細(xì)胞的衰老小鼠，其衰老年齡與壽命顯著延后，該過程中同樣有腦脊液中的干細(xì)胞來源的外泌體中MicroRNA 與抗衰老因子的參與［27］。

2.3 免疫調(diào)節(jié)以提供理想的免疫微環(huán)境：免疫排斥反應(yīng)是限制器官移植術(shù)預(yù)后的重要原因，也是亟待解決的難題。而MSC 的免疫調(diào)節(jié)功能是其備受器官移植專家青睞的重要原因。研究表明，炎癥環(huán)境可以影響外泌體內(nèi)蛋白、核酸等生物分子的特性及表達(dá)量，反之干細(xì)胞也可以借助外泌體傳遞MicroRNA 等遺傳信息有效調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā) 生［28］。例如臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中含有 的MiR-21、MiR-146a、MiR-181 在 組 織 修 復(fù)過程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用［29］。使用炎性因子對MSC 進(jìn)行預(yù)處理可以明顯增強(qiáng)MSC 的免疫調(diào)節(jié)功能，同樣體現(xiàn)在MSC 來源的外泌體中MicroRNA的 表 達(dá) 譜 上［30］。 例 如，MSC 對 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的預(yù)處理后，其免疫調(diào)節(jié)功能得以激活。其后進(jìn)一步影響巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2 方向（即抗炎方向）極化，使得巨噬細(xì)胞抗炎性因素增強(qiáng)，促炎性因素減弱［31］。而這一現(xiàn)象可能與外泌體中的MiR-146a 顯著上調(diào)有關(guān)。下調(diào)MiR-146a 的表達(dá)可以抑制IL-1β 預(yù)處理的MSC 外泌體的免疫調(diào)節(jié)作用［32］。這表明IL-1β 預(yù)處理的MSC 通過改變其外泌體中MiR-146a 的表達(dá)量增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功能。這為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療提供了新的思路，即對MSC 的預(yù)處理后的免疫調(diào)節(jié)功能的增強(qiáng)與其分泌的外泌體直接相關(guān)。MSC 外泌體通過傳遞其內(nèi)攜帶的MicroRNA等遺傳信息，有效發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，為組織修復(fù)過程提供理想的免疫微環(huán)境。

3 MSC 外泌體在器官移植領(lǐng)域的研究及前景

圍繞器官移植的背景，美國內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心大學(xué)專家Mahato 等［33］率先將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其過表達(dá)可以抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)as）表達(dá)的干擾RNA 及抑制MiR-375 表達(dá)的反義RNA。與外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培養(yǎng)過程中將外泌體傳遞至胰島移植術(shù)后大鼠模型體內(nèi)，顯著下調(diào)了該大鼠體內(nèi)Fas 及MiR-375 的表達(dá)水平，繼而通過PBMC 增殖及增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞功能，表現(xiàn)出顯著的改善胰島移植術(shù)后的免疫耐受狀態(tài)的免疫調(diào)節(jié)功能。該研究表明在器官移植領(lǐng)域中，MSC 借助外泌體發(fā)揮出免疫調(diào)節(jié)的作用，有望成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)方向。

目前，對MSC 外泌體直接應(yīng)用于器官移植的研究尚不成熟。但現(xiàn)有的研究提示我們，MSC 在器官移植領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。以肝移植領(lǐng)域?yàn)槔琈SC 外泌體具有的免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)與促血管生成作用是其堅(jiān)實(shí)的機(jī)制基礎(chǔ)［34］。Lai 等［35］通過向發(fā)生移植物抗宿主病模型大鼠體內(nèi)注射MSC 外泌體，可顯著抑制Th-17 和Treg 細(xì)胞的活性，減輕免疫排斥反應(yīng)及病理損傷。Jiang 等［36］的研究表明MSC 外泌體通過減少氧化應(yīng)激、抑制肝細(xì)胞凋亡，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化。此外，有研究表明將MSC 外泌體注射到肝癌小鼠體內(nèi)時(shí)，借助其內(nèi)豐富的抗腫瘤的MiR-122 等多種生物學(xué)分子，有效抑制腫瘤生長，提高化療敏感性，說明MSC 外泌體可能特別適用于肝癌肝移植的患者［37］。

4 總 結(jié)

MSC 在器官移植領(lǐng)域的作用已經(jīng)得到基礎(chǔ)研究的證實(shí)并逐步推向臨床，具有廣闊的應(yīng)用前景。與直接移植MSC 比較，外泌體的體積更小、結(jié)構(gòu)更簡單、穩(wěn)定性更強(qiáng)，更易在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)下獲取與保存，應(yīng)用更為方便，有專家甚至提出了“cell-free therapy（無細(xì)胞參與）”的干細(xì)胞治療策略。相信隨著干細(xì)胞與臨床醫(yī)學(xué)專家對MSC 外泌體相關(guān)研究的深入，終將實(shí)現(xiàn)成熟的干細(xì)胞治療方案，對器官移植事業(yè)的發(fā)展起到重要的促進(jìn)作用。