基于代謝組學(xué)的腎細胞癌生物標(biāo)志物研究進展

邵淵 吳波 王東文

腎細胞癌簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，2020年美國的腎癌年發(fā)病人數(shù)分別占男性和女性新發(fā)腫瘤的第6位和第8位[1]。近年來我國腎癌的發(fā)病率雖然低于世界平均水平，但也呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2-3]。早期腎癌通常無明顯癥狀，超過20%的患者在診斷時已經(jīng)進展為局部晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌，預(yù)后較差[4]。由于腎癌對放療及化療不敏感，因而早期診斷和早期手術(shù)治療顯得尤為重要[5]。當(dāng)前，腎癌的診斷除影像學(xué)檢查外，尚無特異性的腫瘤標(biāo)志物，腎腫物穿刺活檢術(shù)的臨床應(yīng)用也因存在針道轉(zhuǎn)移等風(fēng)險而受到限制[6]。因此，為了改善腎癌患者的預(yù)后，迫切需要尋找和開發(fā)具有臨床應(yīng)用價值的腎癌生物標(biāo)志物。

作為一種新興組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)主要通過質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)和核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR)等技術(shù)平臺定性或定量檢測生物樣本內(nèi)相對分子質(zhì)量小于1 000 D的內(nèi)源性小分子物質(zhì)的變化水平，結(jié)合主成分分析(pincipal component analysis， PCA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis， OPLS-DA)等多元統(tǒng)計學(xué)方法從中挖掘差異代謝產(chǎn)物并進行生物學(xué)解釋[7-8]。由于代謝組學(xué)側(cè)重于反映生物體內(nèi)真實的病理生理變化狀態(tài)，目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤發(fā)生機制的研究以及非侵入性腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[9-11]。作為一種代謝性疾病，腎癌在發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因如VHL、MET等突變與代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)重編程密切相關(guān)[12-14]。因此，通過代謝組學(xué)手段分析腫瘤患者體內(nèi)的差異代謝產(chǎn)物，并從中發(fā)現(xiàn)一種全新有效的腎癌生物標(biāo)志物成為當(dāng)前的研究熱點。

一、基于尿液樣本的腎癌代謝組學(xué)研究

由于尿液直接與泌尿系統(tǒng)接觸且具有收取無創(chuàng)、易于獲取等諸多優(yōu)勢，使其成為腎癌代謝組學(xué)分析的首選生物標(biāo)本[15]。Kim等[16]利用代謝組學(xué)方法分析了29例腎癌患者和33例健康志愿者的尿液樣本，結(jié)果顯示腎癌患者尿液中的喹啉酸含量升高，4-羥基苯甲酸和龍膽酸降低，結(jié)合后續(xù)細胞株實驗表明氨基酸代謝和能量代謝途徑中的喹啉酸和α-酮戊二酸是腎癌潛在的生物標(biāo)志物。在另外一項研究中，Ganti等[17]采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass separetion, GC-MS)的方法分析了不同級別腎癌患者的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)低級別腫瘤中脂酰肉堿的平均值較低，而其濃度在高級別腫瘤患者的尿液中穩(wěn)定增加，表明來自脂肪酸代謝途徑的脂酰肉堿作為潛在的生物標(biāo)志物與腎癌的分級密切相關(guān)。Monteiro等[18]采用GC-MS技術(shù)研究了30例腎癌患者和37例非腎癌志愿者尿液中的揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds, VOCs)。基于這種非靶向分析方法，研究發(fā)現(xiàn)尿液中由21種代謝物構(gòu)成的組合可以有效區(qū)分腎癌患者與非腎癌志愿者，其中的2-氧丙醛和2，5，8-三甲基-1，2，3，4-四氫萘-烯-1-醇變化最為顯著，可以作為潛在的腎癌生物標(biāo)志物。該研究證實了尿液中VOCs的鑒定與評估在腎癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中具有很大的潛力，值得進一步探討與研究。Liu等[19]應(yīng)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass separetion, LC-MS)技術(shù)分析100例腎癌患者與163例非腎癌患者(包括34例良性腎腫瘤和129例健康志愿者)的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)一種腎癌的特征性生物標(biāo)志物—N-甲酰犬尿氨酸。分析結(jié)果顯示，作為一種潛在的腎癌生物標(biāo)志物，色氨酸代謝途徑中的N-甲酰犬尿氨酸在區(qū)分腎癌患者與非腎癌患者時，敏感度和特異度分別達到84.8%及83.8%，具有較高的診斷潛力。最近，Zhang等[20]利用LC-MS技術(shù)進行了一項基于39例腎癌患者、22例良性腎腫瘤患者以及68例健康對照者的尿液代謝組學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌患者尿液中的代謝譜與良性腎腫瘤患者及健康對照者尿液中的代謝譜具有顯著差異。進一步分析顯示，由睪酮等組成的代謝物組在區(qū)分腎癌和良性腎腫瘤時，靈敏度和特異度均為80%，而由氨基己二酸等組成的代謝物組在區(qū)分腎癌患者與健康對照者時，靈敏度和特異度分別為93%和75%。作為潛在的腎癌生物標(biāo)志物，以上兩組代謝物均具有較高的診斷價值。

Ragone等[21]應(yīng)用核磁共振氫譜(proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計方法對40例腎透明細胞腎癌患者、29例健康對照者的尿液樣本進行了分析。結(jié)果表明，腎透明細胞癌患者尿液中水平升高的肌酸、丙氨酸、乳酸和丙酮酸，以及水平降低的馬尿酸、檸檬酸和甜菜堿是腎癌潛在的生物標(biāo)志物。此外，該研究通過分析9例腎切除術(shù)后的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)腎癌患者手術(shù)前后的代謝譜發(fā)生了明顯的變化，提示尿液代謝組學(xué)的分析可能會為腎癌患者的術(shù)后監(jiān)測提供幫助。最近，F(xiàn)alegan等[22]應(yīng)用NMR技術(shù)對74例腎透明細胞癌、6例嫌色細胞腎細胞癌和24例乳頭狀腎細胞癌患者的空腹尿液樣本進行了一項初步研究?；诙嘣y(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示腎癌各亞型之間存在一定的差異，脂肪酸代謝途徑中的乙酰肉堿可能是區(qū)分腎癌組織學(xué)類型的生物標(biāo)志物。這項研究證實尿液代謝組學(xué)可以在腎癌分型診斷中發(fā)揮作用。但限于樣本量的限制，尤其是嫌色細胞腎細胞癌、乳頭狀腎細胞癌等組織學(xué)類型的樣本量較少，有待后續(xù)的大樣本研究進一步探討尿液代謝組學(xué)在腎癌分型診斷中的應(yīng)用。基于以上的研究，尿液代謝組學(xué)為腎癌非侵入性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了新的視角。

二、基于血液樣本的腎癌代謝組學(xué)研究

血清腫瘤標(biāo)志物是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、監(jiān)測腫瘤進展以及評價治療療效的重要方法。因此基于血液樣本的代謝組學(xué)技術(shù)有望在尋找腎癌血液生物標(biāo)志物方面發(fā)揮重要作用。Lin等[23]使用LC-MS和直接輸注大氣壓電離化質(zhì)譜技術(shù)對收集的31例腎癌患者和20例健康志愿者血清樣本進行了分析處理。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，腎癌患者血清中苯乙酰甘氨酸和神經(jīng)節(jié)苷脂水平升高，而溶血磷脂酰膽堿水平明顯下降。進一步研究顯示血清中苯乙酰甘氨酸水平升高與腎癌患者體內(nèi)脂肪酸代謝紊亂有關(guān)，而溶血磷脂酰膽堿和神經(jīng)節(jié)苷脂作為惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。隨后，Lin等[24]進行了一項基于33例腎癌患者及25例健康志愿者的血清代謝組學(xué)研究。分析結(jié)果提示LC-MS分析與多元統(tǒng)計分析相結(jié)合可用于腎癌的診斷及腫瘤標(biāo)志物的篩選，其建立的診斷模型區(qū)分腎癌患者和健康志愿者的敏感性和特異性均達到100%。此外，該研究最終篩選出30個用于腎癌診斷的潛在生物標(biāo)記物，并對其相關(guān)代謝途徑進行了研究，提示腎癌患者體內(nèi)存在脂肪酸代謝、色氨酸代謝等多種代謝途徑的紊亂。

Zira等[25]分析了32例腎癌患者和13例泌尿系良性疾病患者血漿樣本中代謝物的變化情況，結(jié)果表明1H-NMR技術(shù)與PCA相結(jié)合的方法在腎癌診斷中具有潛在的應(yīng)用價值，其篩選出的脂蛋白和膽堿可能是腎癌診斷的生物標(biāo)志物。Zheng等[26]采用基于NMR的血清代謝組學(xué)方法對104例腎癌患者及健康志愿者的血清樣本進行了研究。結(jié)果提示，血清中丙氨酸、肌酸、膽堿、異亮氨酸、乳酸、亮氨酸和纈氨酸不僅可作為潛在的腎癌生物標(biāo)志物，還可用于腎癌的早期診斷，而且可以成為腎癌患者腎切除術(shù)后代謝恢復(fù)的標(biāo)志物。最近，F(xiàn)alegan等[27]應(yīng)用NMR和GC-MS技術(shù)對40例腎癌患者和13例良性志愿者的血清樣本進行了分析。與對照組相比，腎癌患者血清中糖酵解產(chǎn)物丙酮酸和乳酸水平上升, 而三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物琥珀酸、檸檬酸水平降低，進一步證實了腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下，仍然依賴糖酵解的方式產(chǎn)生能量以維持其快速增殖，即沃伯格效應(yīng)(Warburg effect)[28]。此外，該研究通過分析28例pT1期及10例pT3期腎癌患者血清樣本，結(jié)果顯示基于OPLS-DA模型可以有效區(qū)分不同分期的腎癌患者，證明了血清代謝組學(xué)在腎癌的分期診斷方面具有很大的潛力。

三、基于組織樣本的腎癌代謝組學(xué)研究

相較于尿液與血液，組織樣本提供的代謝信息最為豐富。因此，有學(xué)者試圖在腎癌患者的組織樣本中，利用代謝組學(xué)技術(shù)尋找可用于腎癌診斷的特異性標(biāo)志物。Poplawski等[29]采用GC-MS技術(shù)分析了35例腎癌患者腎切除術(shù)后的腫瘤組織及鄰近的正常腎組織，旨在探討腎癌患者體內(nèi)代謝途徑的改變對生存的影響。研究共發(fā)現(xiàn)31種差異代謝物，其中琥珀酸、腺嘌呤、肌醇、次黃嘌呤、尿素和β-丙氨酸作為腎癌生物標(biāo)志物具有較好的診斷價值。進一步分析發(fā)現(xiàn)腎癌組織中的琥珀酸、嘌呤、葡萄糖、β-丙氨酸和肌醇等代謝物水平的變化與腎癌患者的低生存率相關(guān)。Niziol等[30]采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜法分析了腎癌組織與正常腎組織。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝途徑的乙酰肉堿與氨基酸代謝途徑的谷氨酰胺濃度在腫瘤組織中顯著增高，可以作為潛在的腎癌生物標(biāo)志物。Sato等[31]分析了20例腎透明細胞癌患者的癌組織及正常腎組織，共發(fā)現(xiàn)58種差異代謝物，其中來自甘油磷脂、谷胱甘肽、糖酵解等代謝途徑的34種代謝物作為潛在的腎癌生物標(biāo)志物具有較高的診斷能力。進一步分析發(fā)現(xiàn)有9種代謝產(chǎn)物與腫瘤體積顯著相關(guān)，可以作為早期診斷的腎癌生物標(biāo)志物。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)包括α-酮戊二酸和肌醇在內(nèi)的19種代謝產(chǎn)物與臨床病理因素顯著相關(guān)，為腎癌代謝組學(xué)研究帶了新的思路與見解。Gao等[32]利用1H-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計學(xué)方法對31例腎癌組織及癌旁正常組織進行分析。結(jié)果顯示，腎癌組織中的代謝譜與其鄰近癌旁正常組織的代謝譜具有明顯差異。與癌旁組織相比，腎癌組織中谷氨酸、谷氨酰胺水平升高提示腫瘤細胞抗氧化能力的增強，而乳酸和丙酮酸水平的升高以及蘋果酸、琥珀酸、延胡索酸等水平的降低提示腫瘤細胞的三羧酸循環(huán)受到抑制，進而轉(zhuǎn)為有氧糖酵解作為主要的能量來源。以上這些研究結(jié)果表明，基于組織樣本的腎癌代謝組學(xué)研究將促進腎癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與探索。

四、總結(jié)與展望

目前，雖然代謝組學(xué)在腎癌研究中發(fā)展迅速，但也存在著一定的局限性：①到目前為止進行的代謝組學(xué)研究表明，腎癌的代謝特征缺乏特異性；②機體代謝物易受多方面因素的干擾，且樣本制備與分析缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，造成各研究的一致性較差；③部分研究樣本量較少，缺乏有效的內(nèi)部及外部驗證，實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保證；④雖然組織病理學(xué)檢查作為腎癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其臨床標(biāo)本獲取較為困難，不利于腎癌的早期診斷與篩查。

總而言之，基于代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)的腎癌生物標(biāo)志物距離實際臨床應(yīng)用還有一定的距離。然而，越來越多的研究表明，腎癌作為一種代謝性疾病，與糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化及色氨酸途徑的代謝重編程密切相關(guān)(圖1)。因此，了解腎癌的代謝特征有助于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。相對于其它“組學(xué)”技術(shù)，代謝組學(xué)處于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)下游，為腎癌的發(fā)生機制及非侵入性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等多個方面提供了新的視角和貢獻。鑒于個體之間的巨大異質(zhì)性，加之眾多混雜因素的影響，單個生物標(biāo)志物不太可能提供強大的診斷價值，因此，未來研究的方向可能會側(cè)重于一組生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。此外，由于組織樣本提供的代謝信息最為豐富，而血液、尿液代謝組學(xué)研究具有無創(chuàng)性等優(yōu)勢。因此，后續(xù)的研究可將組織代謝組學(xué)與基于血液及尿液的代謝組學(xué)研究相結(jié)合，進一步深入挖掘靈敏度高、特異度強的非侵入性腎癌生物標(biāo)志物。

綜上所述，隨著研究的深入以及技術(shù)的不斷創(chuàng)新，不斷趨于可靠與穩(wěn)定的代謝組學(xué)技術(shù)為癌癥研究提供了一條極具潛力的途徑。通過與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，腎癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用使得以個性化的方式對腎癌進行快速且非侵入性的診斷和隨訪成為可能。