ST3GAL5在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)水平、預(yù)后分析及作用機制的研究

歐陽松 劉繼紅 倪釗 李強 丁國富 王勤章

在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第十二位[1]。膀胱癌中最常見的類型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BLCA)[2]，BLCA按組織學(xué)分級分為高級別BLCA和低級別BLCA，其中低級別BLCA極少侵犯膀胱肌層或其他部位，并且死亡率極低，絕大多數(shù)死亡病例為高級別膀胱癌。而按是否侵犯肌層又分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder, NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder, MIBC)，約75%的新發(fā)膀胱癌為NMIBC，較肌層浸潤病變而言，NMIBC患者生存期較長且腫瘤特異性死亡風(fēng)險較低[3]。因此膀胱癌的早期診斷和治療可改善患者的總體生存狀況，尋找一種新的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點對提高膀胱癌患者的臨床治療水平具有重要意義。

ST3GAL5是一種可編碼神經(jīng)節(jié)苷脂GM3蛋白的編碼基因[4]。神經(jīng)節(jié)苷脂GM3參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、維持成纖維細(xì)胞形態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附[5]。同時，越來越多的證據(jù)表明GM3對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有強大的作用[6]。然而，ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)譜和作用功能尚不清楚。因此，本文基于公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，初步探討ST3GAL5在BLCA中的表達(dá)水平、預(yù)后特征及作用機制。

對象與方法

一、數(shù)據(jù)獲取與處理

所有研究數(shù)據(jù)通過TCGA、GEO、Oncomine、TIMER、GENT、UCSC-Xena、GEPIA2和Kaplan-Meier plotter等公開數(shù)據(jù)庫獲得并處理。其中TCGA數(shù)據(jù)通過UCSC Xena網(wǎng)站(xenabrowser.net/)下載獲得，GEO原始矩陣數(shù)據(jù)通過R語言安裝包“GEOquery”下載并處理，Oncomine表達(dá)數(shù)據(jù)通過網(wǎng)站(www.oncomine.org/)審查元素的

二、ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)

通過Oncomine、GENT2(gent2.appex.kr/gent2)和TIMER2.0(timer.cistrome.org/)數(shù)據(jù)庫挖掘ST3GAL5在不同類型癌癥與對應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平，然后通過Oncomine、GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫分別探討ST3GAL5在膀胱癌與正常膀胱、MIBC與NMIBC、高級別膀胱癌與低級別膀胱癌中的表達(dá)水平。其中Oncomine數(shù)據(jù)庫默認(rèn)設(shè)置為P<1×104，|差異倍數(shù)|>2，基因排名為前10%。GENT數(shù)據(jù)庫使用U133Plus2平臺進(jìn)行分析。TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集、GEO數(shù)據(jù)集GSE13507和Oncomine數(shù)據(jù)集Lee Bladder的數(shù)據(jù)用于膀胱癌與正常膀胱組織的表達(dá)分析，TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集、GEO數(shù)據(jù)集(GSE120736、GSE13507和GSE31684)和Oncomine數(shù)據(jù)集(Blaveri Bladder2、Lee Bladder、Sanchez-Carbayo Bladder2和Stransky Bladder)分別用于MIBC與NMIBC、高級別與低級別膀胱癌的表達(dá)分析。

三、生存預(yù)后分析

通過UCSC-Xena瀏覽器下載TCGA-BLCA的基因表達(dá)水平及生存數(shù)據(jù)，使用R語言安裝包“survival”和“survminer”進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，使用Kaplan-Meier plotter網(wǎng)頁工具(kmplot.com/analysis/)進(jìn)行生存分析驗證，使用GENT2網(wǎng)頁工具(gent2.appex.kr/gent2)進(jìn)行總體生存率Meta分析。

四、功能及通路富集分析

為了進(jìn)一步辨別ST3GAL5不同表達(dá)水平在膀胱癌中的信號通路，采用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)對GEO數(shù)據(jù)集GSE83586進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路驗證。根據(jù)ST3GAL5的表達(dá)均值，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用GSEA軟件4.02版本進(jìn)行分析，基因集置換運行1 000次，以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.25，|標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)|>1及P<0.05為顯著性差異。最后使用R安裝包“Rtoolbox”對GSEA報告進(jìn)行二次繪圖。

結(jié) 果

一、ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫中，ST3GAL5在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和其他癌癥中低表達(dá)，在食管癌、頭頸癌、腎癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓瘤中高表達(dá)；GENT2數(shù)據(jù)庫的U133Plus2平臺中，ST3GAL5在脂肪癌、膀胱癌、血液癌、腦癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、肌肉癌和前列腺癌中表達(dá)下調(diào)；TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫中見8種癌癥ST3GAL5表達(dá)顯著下調(diào)和7種癌癥ST3GAL5表達(dá)顯著上調(diào)。3個獨立數(shù)據(jù)庫均顯示ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)明顯下調(diào)，且ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖1。

A：Oncomine數(shù)據(jù)庫(紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào))；B：GENT2數(shù)據(jù)庫；C：TIMER2.0數(shù)據(jù)庫圖1 ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)

二、ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)

在GEO數(shù)據(jù)集GSE13507、Oncomine數(shù)據(jù)集 Lee Bladder和 TGCA數(shù)據(jù)庫中均提示ST3GAL5在膀胱癌中表達(dá)顯著降低(P=0.004 9、P=5×10-7和P=0.000 17)，見圖2。

A：GEO數(shù)據(jù)集GSE13507；B：Oncomine數(shù)據(jù)集Lee Bladder；C：TCGA數(shù)據(jù)庫圖2 ST3GAL5在BLCA中的表達(dá)

三、ST3GAL5在MIBC中的表達(dá)

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，比較分析后發(fā)現(xiàn)有4組數(shù)據(jù)集提示ST3GAL5在膀胱癌中表達(dá)顯著下調(diào)(P=5.7×10-9、P=4.9×10-9、P=4.9×10-12、P=6×10-10)，見圖3A。對此4組數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析后發(fā)現(xiàn)ST3GAL5在MIBC中表達(dá)顯著下調(diào)(P=2.64×10-9)，見表1。而在GEO數(shù)據(jù)集GSE120736、GSE13507和GSE31684中也均提示ST3GAL5在MIBC中表達(dá)顯著下調(diào)(P=3.8×10-13、P=8.8×10-12和P=3.5×10-6)，見圖3B。其中，TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集中因僅有5例MIBC報道，故未作分析。

表1 Oncomine數(shù)據(jù)集中ST3GAL5表達(dá)下調(diào)的比較

A：Oncomine數(shù)據(jù)集；B：GEO數(shù)據(jù)集圖3 ST3GAL5在MIBC中的表達(dá)

四、ST3GAL5在高級別膀胱癌中的表達(dá)

在4組獨立Oncomine數(shù)據(jù)集中，ST3GAL5 在高級別BLCA中均顯著下調(diào)(P=0.002、P=4.2×10-7、P=6×10-5和P=1.4×10-7)，見圖4A。而在GEO數(shù)據(jù)集GSE120736、GSE13507和GSE31684中也均提示顯著下調(diào)(P=2.6×10-12、P=8.2×10-10和P=0.049)，見圖4B。同樣在TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集也證實其顯著下調(diào) (P=4.2×10-6)，見圖4C。

A：Oncomine數(shù)據(jù)集；B：GEO數(shù)據(jù)集；C：TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集圖4 ST3GAL5在高級別BLCA中的表達(dá)

五、ST3GAL5表達(dá)與膀胱癌的生存關(guān)系分析

在TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集中，在總體生存率、疾病特異性生存率、無疾病間期及無進(jìn)展間期方面，ST3GAL5低表達(dá)組較高表達(dá)組風(fēng)險更高(P=0.002 4、P=0.001 3、P=0.03和P=0.000 48)。見圖5A～5D。而在Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)頁工具中也驗證了在總體生存率及無復(fù)發(fā)生存率方面，ST3GAL5低表達(dá)比高表達(dá)均具有更高的風(fēng)險(P=5×10-4和P=0.007 3)，見圖5E、5F。最后通過GENT2網(wǎng)頁工具對總體生存率作Meta生存分析，同樣提示ST3GAL5低表達(dá)比高表達(dá)均具更高的風(fēng)險[P=0.004，HR=0.622(0.452～0.856)，τ2=0.086，I2=0.884(0.728～0.950)]，見圖5G。以上分析均提示了ST3GAL5在膀胱癌患者中的表達(dá)與預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)性。

A～D：TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集結(jié)果；E～F：Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)頁結(jié)果；G：GENT2網(wǎng)頁結(jié)果圖5 ST3GAL5表達(dá)與膀胱癌的生存關(guān)系分析

六、ST3GAL5低表達(dá)在膀胱癌中的GSEA分析

為了進(jìn)一步確定ST3GAL5在膀胱癌中差異表達(dá)所激活的信號通路，我們對GEO 一項大樣本數(shù)據(jù)集GSE83586中ST3GAL5高表達(dá)組(n=124)和ST3GAL5低表達(dá)組(n=183)之間進(jìn)行了GSEA分析以驗證其KEGG通路，其中低表達(dá)ST3GAL5富集分析結(jié)果見表2。最終，我們確定了3種ST3GAL5低表達(dá)與膀胱癌顯著正相關(guān)的腫瘤相關(guān)途徑：NOD樣受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和JAK-STAT信號通路，見圖6。

表2 ST3GAL5低表達(dá)表型的GESA富集結(jié)果

A：NOD樣受體信號通路；B：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用；C:JAK-STAT信號通路圖6 ST3GAL低表達(dá)在膀胱癌中的GSEA分析

討 論

膀胱癌可分為低級別和高級別病變，同時也可分為非肌層浸潤和肌層浸潤性病變。低級別膀胱癌極少侵犯膀胱肌層且死亡極少。而高級別膀胱癌常侵犯肌層且死亡率高。與此同時，NMIBC的預(yù)后良好(5年生存率為95%，MIBC則為69%)[7]。但是70%的非肌層浸潤疾病通常容易復(fù)發(fā)并且30%在首次治療后可進(jìn)展為肌層浸潤疾病[8]，復(fù)發(fā)和進(jìn)展到高級別導(dǎo)致不良結(jié)果[9]。目前關(guān)于膀胱癌肌層侵犯和高級別進(jìn)展的病因尚不清楚。因此，尋找一種有效的生物標(biāo)志物來預(yù)測膀胱癌的肌層侵犯與否、分級和預(yù)后至關(guān)重要。

目前，對于ST3GAL5表達(dá)對膀胱癌肌層侵犯、分級和預(yù)后的影響尚未見文獻(xiàn)報道，ST3GAL5在膀胱癌中的潛在作用是本研究的重點。本文綜合運用生物信息學(xué)方法對多組獨立的公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ST3GAL5在多種癌癥中低表達(dá)，在膀胱癌中的表達(dá)水平較正常膀胱組織低，在膀胱癌中ST3GAL5的低表達(dá)與肌層侵犯、高分級和預(yù)后不良有一定的關(guān)聯(lián)性。這些結(jié)果提示ST3GAL5可能是膀胱癌的抑癌基因，ST3GAL5可能抑制膀胱癌向肌層侵犯和高級別進(jìn)展，這也提示ST3GAL5可能是膀胱癌的治療靶點。上調(diào)ST3GAL5表達(dá)有可能延緩膀胱癌肌層侵犯和向高級別進(jìn)展，并可能改善患者的總體生存和復(fù)發(fā)狀況。但仍需要進(jìn)一步的研究來探索ST3GAL5在膀胱癌患者進(jìn)展和預(yù)后中的詳細(xì)分子機制。

ST3GAL5催化神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的形成[4]，因此也被稱為GM3合酶。GM3在多種癌癥中過度表達(dá)，可作為腫瘤相關(guān)的糖類抗原，用于癌癥的免疫治療。同時，GM3還可以通過抗血管生成或運動等途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長[5]。有文獻(xiàn)報道GM3在結(jié)腸癌[10]、乳腺癌[11]、肝癌[12]和其他癌癥[6,13]中具有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，雖然已有少量研究表明GM3在人膀胱癌中有抗癌作用[14-16]，但其作用機制和信號通路尚不清楚。因此，在本研究中，我們對一項大樣本的膀胱癌數(shù)據(jù)集(n=307)進(jìn)行了通路驗證，深入探討了其對膀胱癌的信號通路效應(yīng)。

首先，根據(jù)膀胱癌中ST3GAL5的平均表達(dá)值，將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，然后對兩組進(jìn)行GSEA分析。最終我們確定了3種與膀胱癌中ST3GAL5低表達(dá)顯著正相關(guān)的腫瘤相關(guān)途徑：NOD樣受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和JAK-STAT信號通路。NOD樣受體信號通路是一種典型的免疫學(xué)信號通路，與多種人類疾病如感染、癌癥、自身免疫和炎癥性疾病等相關(guān)。NOD樣受體及其下游信號成分與細(xì)胞死亡和自噬途徑形成復(fù)雜的串?dāng)_，這兩種途徑都是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵過程[17]。此外，眾所周知，細(xì)胞因子是重要的細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子和動員因子，參與先天性和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞死亡、血管生成以及旨在恢復(fù)體內(nèi)平衡的發(fā)育和修復(fù)過程[18]。在本研究中，該通路與ST3GAL5的低表達(dá)呈正相關(guān)，表明ST3GAL5的低表達(dá)可能通過影響免疫狀態(tài)而促進(jìn)膀胱組織的癌變。而JAK-STAT信號異常已被證實與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。本研究中的通路分析提示ST3GAL5的低表達(dá)可能通過腫瘤免疫、細(xì)胞因子相互作用和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑影響膀胱癌的進(jìn)展，這些均為膀胱癌的靶向治療和免疫治療提供了新的思路。