ST3GAL5在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)水平、預(yù)后分析及作用機(jī)制的研究

歐陽(yáng)松 劉繼紅 倪釗 李強(qiáng) 丁國(guó)富 王勤章

在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第十二位[1]。膀胱癌中最常見(jiàn)的類型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BLCA)[2]，BLCA按組織學(xué)分級(jí)分為高級(jí)別BLCA和低級(jí)別BLCA，其中低級(jí)別BLCA極少侵犯膀胱肌層或其他部位，并且死亡率極低，絕大多數(shù)死亡病例為高級(jí)別膀胱癌。而按是否侵犯肌層又分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder, NMIBC)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle invasive bladder, MIBC)，約75%的新發(fā)膀胱癌為NMIBC，較肌層浸潤(rùn)病變而言，NMIBC患者生存期較長(zhǎng)且腫瘤特異性死亡風(fēng)險(xiǎn)較低[3]。因此膀胱癌的早期診斷和治療可改善患者的總體生存狀況，尋找一種新的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)提高膀胱癌患者的臨床治療水平具有重要意義。

ST3GAL5是一種可編碼神經(jīng)節(jié)苷脂GM3蛋白的編碼基因[4]。神經(jīng)節(jié)苷脂GM3參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、維持成纖維細(xì)胞形態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附[5]。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)表明GM3對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有強(qiáng)大的作用[6]。然而，ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)譜和作用功能尚不清楚。因此，本文基于公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，初步探討ST3GAL5在BLCA中的表達(dá)水平、預(yù)后特征及作用機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、數(shù)據(jù)獲取與處理

所有研究數(shù)據(jù)通過(guò)TCGA、GEO、Oncomine、TIMER、GENT、UCSC-Xena、GEPIA2和Kaplan-Meier plotter等公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得并處理。其中TCGA數(shù)據(jù)通過(guò)UCSC Xena網(wǎng)站(xenabrowser.net/)下載獲得，GEO原始矩陣數(shù)據(jù)通過(guò)R語(yǔ)言安裝包“GEOquery”下載并處理，Oncomine表達(dá)數(shù)據(jù)通過(guò)網(wǎng)站(www.oncomine.org/)審查元素的

二、ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)

通過(guò)Oncomine、GENT2(gent2.appex.kr/gent2)和TIMER2.0(timer.cistrome.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘ST3GAL5在不同類型癌癥與對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平，然后通過(guò)Oncomine、GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分別探討ST3GAL5在膀胱癌與正常膀胱、MIBC與NMIBC、高級(jí)別膀胱癌與低級(jí)別膀胱癌中的表達(dá)水平。其中Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)設(shè)置為P<1×104，|差異倍數(shù)|>2，基因排名為前10%。GENT數(shù)據(jù)庫(kù)使用U133Plus2平臺(tái)進(jìn)行分析。TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集、GEO數(shù)據(jù)集GSE13507和Oncomine數(shù)據(jù)集Lee Bladder的數(shù)據(jù)用于膀胱癌與正常膀胱組織的表達(dá)分析，TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集、GEO數(shù)據(jù)集(GSE120736、GSE13507和GSE31684)和Oncomine數(shù)據(jù)集(Blaveri Bladder2、Lee Bladder、Sanchez-Carbayo Bladder2和Stransky Bladder)分別用于MIBC與NMIBC、高級(jí)別與低級(jí)別膀胱癌的表達(dá)分析。

三、生存預(yù)后分析

通過(guò)UCSC-Xena瀏覽器下載TCGA-BLCA的基因表達(dá)水平及生存數(shù)據(jù)，使用R語(yǔ)言安裝包“survival”和“survminer”進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，使用Kaplan-Meier plotter網(wǎng)頁(yè)工具(kmplot.com/analysis/)進(jìn)行生存分析驗(yàn)證，使用GENT2網(wǎng)頁(yè)工具(gent2.appex.kr/gent2)進(jìn)行總體生存率Meta分析。

四、功能及通路富集分析

為了進(jìn)一步辨別ST3GAL5不同表達(dá)水平在膀胱癌中的信號(hào)通路，采用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)對(duì)GEO數(shù)據(jù)集GSE83586進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路驗(yàn)證。根據(jù)ST3GAL5的表達(dá)均值，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用GSEA軟件4.02版本進(jìn)行分析，基因集置換運(yùn)行1 000次，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.25，|標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)|>1及P<0.05為顯著性差異。最后使用R安裝包“Rtoolbox”對(duì)GSEA報(bào)告進(jìn)行二次繪圖。

結(jié) 果

一、ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，ST3GAL5在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和其他癌癥中低表達(dá)，在食管癌、頭頸癌、腎癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓瘤中高表達(dá)；GENT2數(shù)據(jù)庫(kù)的U133Plus2平臺(tái)中，ST3GAL5在脂肪癌、膀胱癌、血液癌、腦癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、肌肉癌和前列腺癌中表達(dá)下調(diào)；TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中見(jiàn)8種癌癥ST3GAL5表達(dá)顯著下調(diào)和7種癌癥ST3GAL5表達(dá)顯著上調(diào)。3個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)庫(kù)均顯示ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)明顯下調(diào)，且ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào))；B：GENT2數(shù)據(jù)庫(kù)；C：TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)圖1 ST3GAL5在不同類型癌癥中的表達(dá)

二、ST3GAL5在膀胱癌中的表達(dá)

在GEO數(shù)據(jù)集GSE13507、Oncomine數(shù)據(jù)集 Lee Bladder和 TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)中均提示ST3GAL5在膀胱癌中表達(dá)顯著降低(P=0.004 9、P=5×10-7和P=0.000 17)，見(jiàn)圖2。

A：GEO數(shù)據(jù)集GSE13507；B：Oncomine數(shù)據(jù)集Lee Bladder；C：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)圖2 ST3GAL5在BLCA中的表達(dá)

三、ST3GAL5在MIBC中的表達(dá)

在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，比較分析后發(fā)現(xiàn)有4組數(shù)據(jù)集提示ST3GAL5在膀胱癌中表達(dá)顯著下調(diào)(P=5.7×10-9、P=4.9×10-9、P=4.9×10-12、P=6×10-10)，見(jiàn)圖3A。對(duì)此4組數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析后發(fā)現(xiàn)ST3GAL5在MIBC中表達(dá)顯著下調(diào)(P=2.64×10-9)，見(jiàn)表1。而在GEO數(shù)據(jù)集GSE120736、GSE13507和GSE31684中也均提示ST3GAL5在MIBC中表達(dá)顯著下調(diào)(P=3.8×10-13、P=8.8×10-12和P=3.5×10-6)，見(jiàn)圖3B。其中，TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集中因僅有5例MIBC報(bào)道，故未作分析。

表1 Oncomine數(shù)據(jù)集中ST3GAL5表達(dá)下調(diào)的比較

A：Oncomine數(shù)據(jù)集；B：GEO數(shù)據(jù)集圖3 ST3GAL5在MIBC中的表達(dá)

四、ST3GAL5在高級(jí)別膀胱癌中的表達(dá)

在4組獨(dú)立Oncomine數(shù)據(jù)集中，ST3GAL5 在高級(jí)別BLCA中均顯著下調(diào)(P=0.002、P=4.2×10-7、P=6×10-5和P=1.4×10-7)，見(jiàn)圖4A。而在GEO數(shù)據(jù)集GSE120736、GSE13507和GSE31684中也均提示顯著下調(diào)(P=2.6×10-12、P=8.2×10-10和P=0.049)，見(jiàn)圖4B。同樣在TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集也證實(shí)其顯著下調(diào) (P=4.2×10-6)，見(jiàn)圖4C。

A：Oncomine數(shù)據(jù)集；B：GEO數(shù)據(jù)集；C：TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集圖4 ST3GAL5在高級(jí)別BLCA中的表達(dá)

五、ST3GAL5表達(dá)與膀胱癌的生存關(guān)系分析

在TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集中，在總體生存率、疾病特異性生存率、無(wú)疾病間期及無(wú)進(jìn)展間期方面，ST3GAL5低表達(dá)組較高表達(dá)組風(fēng)險(xiǎn)更高(P=0.002 4、P=0.001 3、P=0.03和P=0.000 48)。見(jiàn)圖5A～5D。而在Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)頁(yè)工具中也驗(yàn)證了在總體生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率方面，ST3GAL5低表達(dá)比高表達(dá)均具有更高的風(fēng)險(xiǎn)(P=5×10-4和P=0.007 3)，見(jiàn)圖5E、5F。最后通過(guò)GENT2網(wǎng)頁(yè)工具對(duì)總體生存率作Meta生存分析，同樣提示ST3GAL5低表達(dá)比高表達(dá)均具更高的風(fēng)險(xiǎn)[P=0.004，HR=0.622(0.452～0.856)，τ2=0.086，I2=0.884(0.728～0.950)]，見(jiàn)圖5G。以上分析均提示了ST3GAL5在膀胱癌患者中的表達(dá)與預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)性。

A～D：TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集結(jié)果；E～F：Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)頁(yè)結(jié)果；G：GENT2網(wǎng)頁(yè)結(jié)果圖5 ST3GAL5表達(dá)與膀胱癌的生存關(guān)系分析

六、ST3GAL5低表達(dá)在膀胱癌中的GSEA分析

為了進(jìn)一步確定ST3GAL5在膀胱癌中差異表達(dá)所激活的信號(hào)通路，我們對(duì)GEO 一項(xiàng)大樣本數(shù)據(jù)集GSE83586中ST3GAL5高表達(dá)組(n=124)和ST3GAL5低表達(dá)組(n=183)之間進(jìn)行了GSEA分析以驗(yàn)證其KEGG通路，其中低表達(dá)ST3GAL5富集分析結(jié)果見(jiàn)表2。最終，我們確定了3種ST3GAL5低表達(dá)與膀胱癌顯著正相關(guān)的腫瘤相關(guān)途徑：NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和JAK-STAT信號(hào)通路，見(jiàn)圖6。

表2 ST3GAL5低表達(dá)表型的GESA富集結(jié)果

A：NOD樣受體信號(hào)通路；B：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用；C:JAK-STAT信號(hào)通路圖6 ST3GAL低表達(dá)在膀胱癌中的GSEA分析

討 論

膀胱癌可分為低級(jí)別和高級(jí)別病變，同時(shí)也可分為非肌層浸潤(rùn)和肌層浸潤(rùn)性病變。低級(jí)別膀胱癌極少侵犯膀胱肌層且死亡極少。而高級(jí)別膀胱癌常侵犯肌層且死亡率高。與此同時(shí)，NMIBC的預(yù)后良好(5年生存率為95%，MIBC則為69%)[7]。但是70%的非肌層浸潤(rùn)疾病通常容易復(fù)發(fā)并且30%在首次治療后可進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)疾病[8]，復(fù)發(fā)和進(jìn)展到高級(jí)別導(dǎo)致不良結(jié)果[9]。目前關(guān)于膀胱癌肌層侵犯和高級(jí)別進(jìn)展的病因尚不清楚。因此，尋找一種有效的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)膀胱癌的肌層侵犯與否、分級(jí)和預(yù)后至關(guān)重要。

目前，對(duì)于ST3GAL5表達(dá)對(duì)膀胱癌肌層侵犯、分級(jí)和預(yù)后的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，ST3GAL5在膀胱癌中的潛在作用是本研究的重點(diǎn)。本文綜合運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)多組獨(dú)立的公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ST3GAL5在多種癌癥中低表達(dá)，在膀胱癌中的表達(dá)水平較正常膀胱組織低，在膀胱癌中ST3GAL5的低表達(dá)與肌層侵犯、高分級(jí)和預(yù)后不良有一定的關(guān)聯(lián)性。這些結(jié)果提示ST3GAL5可能是膀胱癌的抑癌基因，ST3GAL5可能抑制膀胱癌向肌層侵犯和高級(jí)別進(jìn)展，這也提示ST3GAL5可能是膀胱癌的治療靶點(diǎn)。上調(diào)ST3GAL5表達(dá)有可能延緩膀胱癌肌層侵犯和向高級(jí)別進(jìn)展，并可能改善患者的總體生存和復(fù)發(fā)狀況。但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)探索ST3GAL5在膀胱癌患者進(jìn)展和預(yù)后中的詳細(xì)分子機(jī)制。

ST3GAL5催化神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的形成[4]，因此也被稱為GM3合酶。GM3在多種癌癥中過(guò)度表達(dá)，可作為腫瘤相關(guān)的糖類抗原，用于癌癥的免疫治療。同時(shí)，GM3還可以通過(guò)抗血管生成或運(yùn)動(dòng)等途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道GM3在結(jié)腸癌[10]、乳腺癌[11]、肝癌[12]和其他癌癥[6,13]中具有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，雖然已有少量研究表明GM3在人膀胱癌中有抗癌作用[14-16]，但其作用機(jī)制和信號(hào)通路尚不清楚。因此，在本研究中，我們對(duì)一項(xiàng)大樣本的膀胱癌數(shù)據(jù)集(n=307)進(jìn)行了通路驗(yàn)證，深入探討了其對(duì)膀胱癌的信號(hào)通路效應(yīng)。

首先，根據(jù)膀胱癌中ST3GAL5的平均表達(dá)值，將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，然后對(duì)兩組進(jìn)行GSEA分析。最終我們確定了3種與膀胱癌中ST3GAL5低表達(dá)顯著正相關(guān)的腫瘤相關(guān)途徑：NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和JAK-STAT信號(hào)通路。NOD樣受體信號(hào)通路是一種典型的免疫學(xué)信號(hào)通路，與多種人類疾病如感染、癌癥、自身免疫和炎癥性疾病等相關(guān)。NOD樣受體及其下游信號(hào)成分與細(xì)胞死亡和自噬途徑形成復(fù)雜的串?dāng)_，這兩種途徑都是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程[17]。此外，眾所周知，細(xì)胞因子是重要的細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子和動(dòng)員因子，參與先天性和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞死亡、血管生成以及旨在恢復(fù)體內(nèi)平衡的發(fā)育和修復(fù)過(guò)程[18]。在本研究中，該通路與ST3GAL5的低表達(dá)呈正相關(guān)，表明ST3GAL5的低表達(dá)可能通過(guò)影響免疫狀態(tài)而促進(jìn)膀胱組織的癌變。而JAK-STAT信號(hào)異常已被證實(shí)與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。本研究中的通路分析提示ST3GAL5的低表達(dá)可能通過(guò)腫瘤免疫、細(xì)胞因子相互作用和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑影響膀胱癌的進(jìn)展，這些均為膀胱癌的靶向治療和免疫治療提供了新的思路。