氧化石墨烯生物傳感器應用研究進展

劉海燕，白云峰，秦 君，李 江，馮 鋒

（山西大同大學有機化學研究所，山西大同 037009）

1 氧化石墨烯及其特點

單層氧化石墨烯（graphene oxide,GO）是石墨經(jīng)化學方法強氧化后再剝離得到的。GO 表面含有羥基、環(huán)氧基、羧基、苯環(huán)、內(nèi)酯基及醌基等多種功能團。其中親水性的極性含氧基團不僅使GO在溶劑特別是水中呈現(xiàn)良好的分散性，而且使GO 能穩(wěn)定地分布在不同的基質(zhì)上。同時GO在能量轉(zhuǎn)移體系中，可作為優(yōu)良的能量受體，能量可以從染料轉(zhuǎn)移到GO上，染料的熒光遂被猝滅。另外，GO不僅可以通過表面化學增強機制增強拉曼信號，而且具有類似過氧化物酶的催化活性。GO 還具有電活性特征，可實現(xiàn)可逆的電還原和氧化?；贕O 的上述特性，GO 被越來越多地應用到生物傳感器中對核酸、小分子蛋白質(zhì)進行檢測。

2 GO與核酸的作用

因GO 表面積大，可通過π-π堆積作用結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），并且ssDNA的結(jié)合力明顯強于雙鏈DNA（dsDNA）。Lu 等通過研究發(fā)現(xiàn)，GO 可以與結(jié)合了熒光團的ssDNA進行結(jié)合并猝滅其熒光，但是對于dsDNA 或者ssDNA 的二級和三級結(jié)構(gòu)作用較小[1]。Fan 等對GO 與不同類型DNA 的相互作用進行了分子動力學模擬[2]。Wu等通過研究發(fā)現(xiàn)，短鏈DNA結(jié)合在石墨烯上的速度更快，結(jié)合力更強[3]。Yang小組對ssDNA結(jié)合在GO上的能力和穩(wěn)定性進行了研究。結(jié)果表明，ssDNA 可以穩(wěn)定結(jié)合在GO的表面且這種結(jié)合可以有效地防止DNA 被酶切[4]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，ssDNA/ssRNA-GO 被廣泛地應用于生物傳感器設計中。

3 基于GO的生物傳感器

3.1 基于GO的熒光生物傳感器

GO 作為熒光猝滅劑，因其具有兩親性，所以具有很強的吸附能力，不僅可以通過π-π作用力吸附含芳香環(huán)的疏水性分子，也可以通過氫鍵吸附親水性物質(zhì)。如果吸附的物質(zhì)連接有熒光染料，GO 與燃料之間可以進行能量轉(zhuǎn)移，從而導致熒光猝滅，背景信號降低。在利用DNA 或RNA 探針的傳感器中，標記有熒光基團的DNA 或RNA 探針首先會被吸附在GO表面引起熒光猝滅。接著靶分子的添加，會使核酸被解吸附，熒光團與GO 距離增大，熒光恢復?；诖嗽?，利用熒光基團標記的互補核苷酸或適配體作為識別單元的GO熒光傳感器被廣泛應用于DNA、蛋白質(zhì)和其它小分子的檢測。

3.1.1 基于適配體的GO熒光傳感器（FRET）

核酸適配體是可以通過折疊成不同的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)實現(xiàn)與靶標分子特異性結(jié)合的DNA或者RNA。它是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）篩選獲得的堿基數(shù)一般為20～100 個左右的單鏈寡聚核苷酸。通過修飾適配體，Apiwat 等利用GO 構(gòu)建了一個診斷和監(jiān)測糖尿病人糖化白蛋白的適配體熒光傳感器。該方法利用的是一個包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的并且可以與糖尿病標志物糖化白蛋白結(jié)合的適配體。經(jīng)過條件優(yōu)化，該傳感器的最低檢測限為50 μg/ mL[5]。以此為基礎，Zhang 等將尺寸效應引入到傳統(tǒng)適配體傳感器中，通過控制GO的納米尺寸來提高傳感器性能構(gòu)建了一個可進行精確控制的新型熒光傳感器[6]。

適配體熒光傳感器的研究不僅集中在分子水平的檢測，而且已延伸到細胞水平的應用。利用適配體和GO構(gòu)建的熒光傳感器可以有效捕獲并識別多種類型循環(huán)腫瘤細胞而且可從多種類型的腫瘤細胞中捕獲循環(huán)腫瘤細胞，具有良好的選擇性[7]。

3.1.2 基于碳點和上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料標記的GO熒光傳感器

碳點（C-dots,CD）因易合成、反應過程簡單和光穩(wěn)定性高，被認為是一種良好的熒光標記染料。將CD和上轉(zhuǎn)換納米粒子應用于傳感器中可克服傳統(tǒng)熒光染料成本高、光穩(wěn)定性差等缺點。用CDs標記的寡脫氧核糖核苷酸和GO 構(gòu)建的Hg2+的傳感器可實現(xiàn)對Hg2+高靈敏度和高選擇性檢測，最低檢測限達到2.6 nmol/L[8]。

稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在光激發(fā)時，不僅可以發(fā)射比激發(fā)波長短的光，而且其吸收的光子能量低于發(fā)射的光子能量。Alonso-Cristobal 等利用GO 和上轉(zhuǎn)換材料構(gòu)建了一個傳感器用于DNA 檢測。目標DNA 存在時，可使DNA 功能化的上轉(zhuǎn)換納米粒子遠離GO并發(fā)出強熒光[9]。

3.1.3 基于非共價標記的GO熒光傳感器

金屬納米團簇因其熒光性質(zhì)可以被用來組裝非共價標記的熒光傳感器。其中銀納米簇因其固有的高量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性被廣泛使用。利用“Y”狀DNA 模板的臂捕獲銀離子組成納米團簇狀結(jié)構(gòu)和與GO 構(gòu)建的微小RNA（MicroRNA,miRNA)傳感器，在無目標miRNA時，“Y”狀DNA中的單鏈環(huán)狀部分可以被GO 吸附在表面，熒光強度很低。但存在目標miRNA 時，目標miRNA 會因與“Y”狀DNA形成了雙鏈而不被GO吸附，導致熒光恢復[10]。

用脂質(zhì)體包裹卟啉作為探針對靶酶的膜孔轉(zhuǎn)化活性進行檢測。由于靶酶可以將脂質(zhì)體膜破壞，卟啉泄漏，并被GO 吸附，使得熒光猝滅。利用手性釕配合物與GO反應設計的適配體傳感器可對凝血酶進行高選擇性和高靈敏度的檢測[11]。

3.1.4 基于生物酶的GO熒光傳感器

利用生物酶的循環(huán)信號放大法如滾環(huán)擴增法、聚合酶鏈式反應、連接酶鏈反應等可以使熒光信號強度顯著增強。Ju 等構(gòu)建了一個利用核酸外切酶III進行信號放大的免標記傳感器用于對DNA檢測[12]。

基于Nicking核酸內(nèi)切酶和GO構(gòu)建的信號放大型熒光適配體傳感器利用裂開型分子信標，對生物樣品中的血管內(nèi)皮生長因子和ATP 進行高靈敏度檢測，檢測最低限分別達到1 pmol/L和4 nmol/L[13]。Nicking 核酸內(nèi)切酶的使用，使傳感器中適配體在信號放大過程中更加穩(wěn)定，并且降低了背景假信號。

脫氧核酶（DNAzyme）是一類由DNA 組成的酶。1994 年，Breaker 和Joyce 研究發(fā)現(xiàn)脫氧核酶可以識別底物核酸的特殊序列并且催化水解反應[14]。Zhao 等首次通過有機染料標記的脫氧核酶進行底物雜交構(gòu)建了一個用于檢測Pb2+的GO 傳感器[15]。利用RNA 裂解嵌合DNA 酶（RCDzyme）構(gòu)建的基于GO 的酶信號循環(huán)放大的傳感器，用富G 序列替代鈾酰特異脫氧核酶的部分序列可用于鈾的檢測。脫氧核酶不僅作為目標識別元件，還是信號擴增的引物。當鈾存在時，脫氧核酶的底物鏈被裂解并與另外一個底物鏈雜交，從而引起重復裂解循環(huán)。富含鳥嘌呤的寡核苷酸片段形成的G-四鏈體會與NMM結(jié)合，從而導致熒光大幅增強。利用GO 吸附游離ssDNA和NMM后，最低檢測限可達到86 pmol/L[16]。

3.2 基于GO的SPR傳感器

與傳統(tǒng)利用金屬薄膜的SPR傳感器相比，石墨烯材料或其衍生物與金屬一起可引起更顯著的SPR信號變化[17]。石墨烯材料或其衍生物可提高SPR傳感器對折射率的靈敏度。石墨烯作為一種非等離子體材料，可以與金（Au）、銀（Ag）等等離子體材料結(jié)合。結(jié)合后，當電荷從多孔石墨烯轉(zhuǎn)移到表面時會引起較大的SPR 信號變化[18]。Xue 團隊對SPR 傳感時GO和染色劑的反應進行研究，發(fā)現(xiàn)GO氧化態(tài)變化會影響其反射特性從而影響檢測的靈敏度[19]。

3.2.1 基于共價結(jié)合的SPR傳感器

因GO與蛋白質(zhì)具有強共價結(jié)合能力，GO片層可作為媒介被用于蛋白質(zhì)結(jié)合程度的實時監(jiān)測。利用GO 薄膜構(gòu)建傳感器對胎牛血清進行檢測，最低檢測限低至100 ng/L[20]。通過肺癌標志物細胞角蛋白-19(KRT-19)與固定在羧基修飾的GO（(GOCOOH)）芯片上的KRT-19受體結(jié)合構(gòu)建的易組裝、高選擇性、高靈敏度的SPR 傳感器，可實現(xiàn)對非小細胞肺癌的診斷檢測[21]。Zhang 等利用金納米棒修飾的GO構(gòu)建了檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白的傳感器。通過轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的檢測可對急性肝炎、貧血、妊娠、風濕、惡性腫瘤和急性白血病進行輔助診斷[22]。

3.2.2 基于GO的LSPR傳感器

GO 不僅可使傳感器的檢測靈敏度增強還可防止電化學LSPR 傳感器基底被氧化。利用rGO/Ag NPs 構(gòu)建的氣敏傳感器，其氣體誘導引起的等離子體激元移動及電導率響應變化均高于單獨使用AgNPs 的傳感器。利用GO 與AuNPs 構(gòu)建的LSPR傳感器中，GO 被用來固定DNA 分子，而AuNPs 可增強SPR 信號，實現(xiàn)了對miRNA 和腺苷的高靈敏度檢測[23]。

3.2.3 基于GO納米復合材料的SPR傳感器

利用GO合成的納米復合物在生物反應的檢測中具有高靈敏度。Kamali 等用化學還原法合成了Ag-GO 納米復合材料,對多巴胺、抗壞血酸和尿酸的光強檢測的最低限分別為49、634 和927 nmol/L，基于相位檢測的最低限分別為30 nmol/L、1.64μmol/L和2.15 μmol/ L[24]。將PDA-Ag@Fe3O4/rGO (Polydopamine-Ag@Fe3O4/reduced graphene oxide）構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)的IgG 傳感器，靈敏度遠高于傳統(tǒng)金芯片，檢測范圍為0.019～40.00 μg/mL[25]。

3.2.4 基于光纖/光纖光柵的SPR傳感器

Wang等利用GO和羊抗人IgG通過鍍銀聚合物包覆石英光纖構(gòu)建傳感器對人IgG 進行了檢測，最低檢測限達到0.04 g/ L[26]。利用GO 作為傳感元件，并用光纖光柵來增強SPR 光線強度，靈敏度是傳統(tǒng)金膜SPR傳感器的2.5倍[27]。

3.3 基于GO的SERS傳感器

GO 是一種具有拉曼活性的探針分子，具有特征性的拉曼光譜。GO 可通過吸附在表面的拉曼探針的化學增強效應來增強拉曼信號?；谏鲜鎏攸c，GO 被認為是一種良好的表面增強拉曼散射的基質(zhì)。

3.3.1 GO作為拉曼活性探針分子

GO 與金屬納米粒子結(jié)合可以增強拉曼信號。貴金屬AuNPs常被用來與GO結(jié)合作為增強拉曼散射的細胞成像劑，但該復合物的合成過程比較復雜。2015 年，Kim 等報道了用GO 作為金的還原劑和穩(wěn)定劑實現(xiàn)了簡單地一鍋法合成用于細胞成像劑的Au@GO納米膠體粒子的方法[28]。

3.3.2 GO作為SERS的基質(zhì)

利用GO復合結(jié)構(gòu)對全血中阿爾茨海默病生化標志物進行免標記、高選擇性分離檢測的拉曼生物傳感器，通過將抗體與GO 結(jié)合后增強拉曼信號并利用金殼進行協(xié)同增強來對靶標進行分離和富集[29]。

3.4 基于GO的電化學傳感器

GO 具有可逆電氧化還原的電活性特性，而還原氧化石墨烯（rGO）有跟石墨烯相似的低電荷轉(zhuǎn)移電阻和良好的電化學性能。所以GO/ rGO 可用來構(gòu)建電化學生物傳感器?；贕O的電化學傳感器可用來檢測酶活性、DNA、蛋白質(zhì)和癌細胞。

3.4.1 利用rGO 作為電化學活性分子進行富集的電化學傳感器

當rGO附在電極上時，會因電化學反應產(chǎn)生電化學信號。2015 年，Chen 等利用rGO 設計了一個靈敏的細胞凋亡檢測體系。該體系將N端乙酰化肽基質(zhì)固定在金電極上。當來源于凋亡細胞的半胱天冬酶-3存在時，基質(zhì)的活性胺端被水解釋放，然后與rGO結(jié)合。其中亞甲藍可以通過π-π與rGO相互作用，從而放大信號。利用該傳感器系統(tǒng)對人肺癌細胞凋亡情況進行檢測，檢測到的細胞凋亡的最低限為0.06 ng/L[30]。

3.4.2 利用rGO合成復合材料的電化學傳感器

為了提高基于GO/ rGO 的電化學生物傳感器的性能，有學者提出用導電材料來制備復合材料。Liu 等人設計了一種利用GO 制備復合材料的放大型電化學發(fā)光傳感器對五氯苯酚進行高靈敏度檢測[31]。將無機納米粒子與rGO結(jié)合后構(gòu)建的電化學傳感器利用ssDNA/AuNP/ rGO 修飾的玻璃碳電極對靶DNA 實現(xiàn)了高選擇性檢測[32]。另外，由殼聚糖、魚骨狀的Fe2O3和還原GO組成的復合物具有優(yōu)良的電催化活性，被用來構(gòu)建對沒食子酸進行高靈敏度的檢測的傳感器[33]。Wei 團隊利用草魚皮膠原蛋白GO復合物與適配體設計了電化學傳感器對多巴胺進行了檢測，最低檢測限達到0.75 nmol/L[34]。利用氨基化還原氧化石墨烯（amino-rGO）對絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE）進行修飾后構(gòu)建的溶菌酶傳感器，用交流阻抗法（EIS）和差分脈沖伏安法（DPV）進行檢測的最低限分別為2.1和4.2 fmol/L[35]。

3.4.3 基于特異性探針修飾的電化學傳感器

為了增強傳感器的選擇性，Li等將分子印跡法應用到電化學傳感器設計中，并研制了一個高靈敏度和高選擇性的晚霞黃電化學傳感器。與傳統(tǒng)傳感器相比，該傳感器縮短了結(jié)合時間，并減弱了導電性。該體系對食品添加劑晚霞黃的最低檢測限為2.0×10-9mol/L[36]。通過利用GO/AuNPs/抗體修飾的電極設計的雙信號電化學免疫傳感器，可以對來源于與抗體共軛結(jié)合的AgNPs/碳納米復合材料的直接氧化電流和來源于對苯二酚的間接還原電流進行監(jiān)測從而實現(xiàn)對IgG 的檢測，且利用此傳感器可對血清中的人IgG 進行檢測，最低檢測限可達到0.001 μg/L[37]。在此基礎上，Ali等構(gòu)建了由介孔rGO 和氧化鎳組成的阿樸脂蛋白B100 功能化的納米復合材料用于對低密度脂蛋白分子進行高靈敏度檢測[38]。

3.5 基于GO的比色傳感器

與天然酶相比，GO 具有更高穩(wěn)定性的過氧化物酶樣活性。GO 可以為過氧化物酶樣物質(zhì)的組裝提供表面而提高穩(wěn)定性和催化活性。探針修飾的GO 可被用來建立靶向特異性的比色生物傳感器。在過氧化物酶底物H2O2和四甲基聯(lián)苯胺共同存在時，GO可利用氧化型四甲基聯(lián)苯胺產(chǎn)生藍光。

基于GO的比色生物傳感器主要由復合過氧化物酶類的納米粒子組成，以提高傳感器的靈敏度。2015 年，Zhang 等提出了一種基于靶分離和GO/PtAuNP 催化活性的超靈敏、選擇性的三磷酸腺苷（ATP）生物傳感器。ATP 既與GO/PtAuNP 修飾的適配體結(jié)合又與連接了磁珠的適配體結(jié)合。經(jīng)結(jié)合形成的復合物經(jīng)過磁分離后，可與H2O2和四甲基聯(lián)苯胺反應呈現(xiàn)藍色。該傳感器的最低檢測限為0.2 nmol/ L。另外，用肉眼可以清晰地分辨出50 nmol/L的顏色變化[39]。Chau等設計了一個基于Pt/rGO的檢測特定DNA序列的比色傳感器。當靶DNA 與Pt/rGO 上的探針雜交時，納米復合材料會因鹽誘導而聚集。離心后，剩余的納米復合材料呈現(xiàn)藍色[40]。Yang 團隊利用IrO2/rGO 納米復合材料構(gòu)建了一個檢測生物硫醇的比色傳感器，實現(xiàn)對生物硫醇的快速、高靈敏檢測[41]。

4 展望

GO 作為一種良好的生物材料，因其具有較好的生物相容性、巨大的比表面積、優(yōu)良的光學性質(zhì)和豐富的活性位點而備受關注，已被廣泛應用于各類生物傳感器。但將GO應用于傳感器仍有以下問題有待進一步研究和改進：首先，GO 的制備方法需要進一步改進，在制備工藝上有較大的提升空間；另外，基于GO 的傳感器在細胞中的應用及其作用機理、GO 對細胞的長期毒性及其代謝途徑有待進一步探索?？傊S著對GO 及其復合材料的深入研究，GO 將被更廣泛地應用于生物傳感器構(gòu)建，發(fā)揮其舉足輕重的作用。