曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制最新研究進(jìn)展

劉登科，牛虹博，葛正茂，劉宇鵬

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第967醫(yī)院ICU，遼寧大連 116000）

曲霉菌在自然界中分布廣泛且種屬眾多，在濕潤的土壤、谷類中都可存在[1-2]。其本身為條件致病菌，正常情況下不致病，但是當(dāng)人體免疫功能下降時，即可侵入人體，造成侵襲性曲霉菌?。╥nvasiveAspergillosis,IA）[3]。因為IA的死亡率高、早期診斷率低[4-5]，所以針對曲霉菌的殺菌藥物就顯得尤為重要。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6]，其中伏立康唑（voriconazole，VRC）被美國的最新指南推薦為曲霉菌病的一線治療藥物[7]。但越來越多的研究顯示，曲霉菌在世界范圍內(nèi)對于唑類藥物的耐藥率逐漸升高，給臨床治療帶來極大困難，嚴(yán)重威脅了病患的生命安全[5-6]。由于多烯類藥物具有較強的毒性，棘白霉素類藥物的價格較為昂貴，因此唑類藥物是治療曲霉菌感染的一線藥物[8-9]，因此本文就曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監(jiān)測以及新型治療藥物作用靶點的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 曲霉菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制

1.1 外排系統(tǒng)過表達(dá)將抗菌物質(zhì)泵出菌體外 外排系統(tǒng)的過表達(dá)是曲霉菌對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性的一種重要機制，相關(guān)作用基因主要是三磷酸腺苷結(jié)合盒蛋白(ATP - binding cassette transporter，ABC) 超家族和主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(the major facilitator superfamily，MFS)超家族[10]。有關(guān)文獻(xiàn)顯示，釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白參與了釀酒酵母對唑類藥物的耐藥，而CHAMILOS等[11]人在煙曲霉中發(fā)現(xiàn)的12個ABC轉(zhuǎn)運蛋白與釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白同源，提示人們ABC轉(zhuǎn)運蛋白可能與煙曲霉對唑類的耐藥相關(guān)。到目前為止，已知的與耐唑相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白有5個：AfuMDR1，AfuMDR2，AfuMDR3，AfuMDR4和AtrF。AfuMDR1和AfuMDR2 是最早被報道的ABC轉(zhuǎn)運蛋白，直接參與了煙曲霉對藥物的外泵作用[12]，而AtrF則是分離自對伊曲康唑(itraconazole，ITC)耐藥的臨床煙曲霉株，對ITC耐藥株中AtrF mRNA的表達(dá)水平是對ITC敏感株的5倍[13]。還有報道表明，對ITC耐藥菌株中轉(zhuǎn)運蛋白AfuMDR3和AfuMDR4的表達(dá)上調(diào)[14]；對泊沙康唑（posaconazole，POS）耐藥煙曲霉株中AfuMDR4 的表達(dá)上調(diào)[15]。MFS與AfuMDR3具有相似性，SUN等[16]人通過研究發(fā)現(xiàn)，MFS轉(zhuǎn)運蛋白Mdr1p可以通過細(xì)胞膜的質(zhì)子梯度為轉(zhuǎn)運體提供能量，其過表達(dá)可導(dǎo)致曲霉菌對唑類藥物耐藥性的產(chǎn)生。然而，關(guān)于曲霉菌外排系統(tǒng)過表達(dá)將唑類藥物泵出菌體外的機制尚未研究透徹，還需要進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

1.2 曲霉菌生物膜的產(chǎn)生 曲霉菌的耐藥性可以通過生物膜的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)，生物膜不僅可以在惡劣環(huán)境中保護(hù)病原體，還能引起暫時性的對抗真菌藥物的耐藥性[17-18]。此前MOWAT等[19]人在培養(yǎng)曲霉菌時發(fā)現(xiàn)其形成的生物膜結(jié)構(gòu)對抗真菌藥物具有耐藥性，隨后BEAUVAIS等[20]人則報道了煙曲霉菌落表面的細(xì)胞外基質(zhì)的作用。他們認(rèn)為煙曲霉細(xì)胞外基質(zhì)有助于菌絲結(jié)合在一起形成生物膜結(jié)構(gòu)，阻止藥物擴散到真菌感染部位，從而降低了藥物敏感度。PAUL等[17]人也認(rèn)為生物膜的形成是曲霉菌對抗真菌藥物的高最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的原因。此外，在生物膜結(jié)構(gòu)中，多種耐藥蛋白被激活，也可通過主動外排系統(tǒng)泵出抗真菌藥物[15]。生物膜有關(guān)感染的死亡率極高，現(xiàn)有藥物治療難以治愈，因此對生物膜在耐藥性中的研究十分重要。

1.3 曲霉菌自身基因的改變

1.3.1 cyp51的突變與過表達(dá)：目前常用的抗真菌藥物的作用機理主要是通過干擾麥角固醇的生物合成來影響真菌細(xì)胞膜的形成[21]。自1997年首次報道煙曲霉唑類耐藥菌株以來，越來越多的人對其耐藥分子機制進(jìn)行了探討[22]。在煙曲霉屬中，唑類藥物的目標(biāo)是蛋白cyp51，它有兩個同源的基因編碼，即cyp51A和cyp51B，其序列一致性為63%，相關(guān)研究表明，大多數(shù)煙曲霉唑耐藥株的出現(xiàn)都與cyp51A的點突變有關(guān)[23]。在煙曲霉菌中羊毛甾醇 14-α-脫甲基酶由cyp51A編碼，是真菌細(xì)胞膜重要成分麥角固醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶。唑類抗真菌藥中的氮原子可以結(jié)合位于cyp51A活性位點的血紅素的鐵原子上。通過這種方法，可以阻斷羊毛甾醇第14位碳原子的脫甲基作用，從而干擾麥角固醇的合成。缺乏麥角固醇會改變細(xì)胞膜的流動性，導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡[5,24]。

如前所述，大多數(shù)耐唑類菌株cyp51A發(fā)生了改變，而cyp51B在煙曲霉耐唑類藥物菌株中的作用尚不清楚。近年來，也有相關(guān)研究報道了cyp51B在唑類耐藥臨床分離菌株中的作用[25]，BUIED等[26]人在所分離得到的12株煙曲霉臨床耐藥菌株中均發(fā)現(xiàn)了cyp51B的過表達(dá)。隨后他們對cyp51B過表達(dá)的菌株進(jìn)行了基因敲除，又對唑類藥物敏感的菌株進(jìn)行了cyp51B的過表達(dá)，驗證了cyp51B的過表達(dá)與曲霉菌對唑類藥物的耐藥有關(guān)這一發(fā)現(xiàn)。

1.3.2 hapE的突變：hapE是CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物亞基，hapE的突變所引起的煙曲霉對唑類藥物耐藥是近年來發(fā)現(xiàn)的一種基因突變所致的耐藥機制[27]。這一發(fā)現(xiàn)由CAMPS等[28]人于2012年發(fā)現(xiàn)并提出，他們通過全基因組測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等多種方法證明了hapE中P88L的替換是導(dǎo)致煙曲霉對唑類藥物耐藥性產(chǎn)生的原因。hapE的突變會引起其與CCAAT復(fù)合物之間的親和力變低，而減少了功能性CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物后又會造成曲霉菌致病力的減弱。GSALLER等[29]人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作為調(diào)控麥角固醇合成的負(fù)作用因子，若其減少，將會解除包括cyp51在內(nèi)的多種關(guān)于麥角固醇合成的基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制，造成麥角固醇的增多和耐藥菌株的產(chǎn)生。

1.4 環(huán)境對耐藥株的產(chǎn)生和傳播 此外，環(huán)境對耐藥株的產(chǎn)生和傳播作用也不可忽視。多種唑類殺菌劑廣泛用于農(nóng)作物的保護(hù)，這些唑類殺菌劑的分子結(jié)構(gòu)與三唑類藥物相似，但曲霉菌并不是在農(nóng)業(yè)中使用殺菌劑的目標(biāo)病原體，曲霉菌在自然界分布廣泛，土壤、作物中都有其孢子的存在，因此用殺菌劑處理過的作物上的真菌暴露于高濃度的唑類物質(zhì)中[5]，導(dǎo)致了耐藥株的產(chǎn)生和傳播[5,22,30]。截至目前，歐洲是煙曲霉對唑類藥物耐藥性最高的地區(qū)，其中基因型為TR34/L98H，TR46/Y121F/T289A的耐藥菌株已在歐洲各地發(fā)現(xiàn)，且被報道與農(nóng)業(yè)殺菌劑的廣泛使用有關(guān)[22,31]。雖然對亞太地區(qū)報告表明，其三唑耐藥率低于歐洲，但也出現(xiàn)了部分新型耐藥菌株[30,32]，亞太地區(qū)和歐洲曲霉菌唑類藥物耐藥率的差異可能是由于亞洲國家對唑類殺菌劑的使用較少所致[5]。

1.5 其他作用導(dǎo)致的耐藥性的產(chǎn)生 熱休克蛋白90 (heat shock proteins90，Hsp90)是一種真核分子伴侶蛋白，可以在環(huán)境作用下調(diào)控蛋白的折疊、運輸和成熟[33]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶不僅是Hsp90的沉默蛋白之一，還是鈣信號通路的重要組成部分，在對唑類藥物的耐藥性中也發(fā)揮著一定作用。有關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，抑制了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后，煙曲霉對唑類藥物的耐藥性也隨之下降[5,9]。

外源性膽固醇在有氧條件可以作為麥角固醇的替代物，也是一種導(dǎo)致曲霉菌對唑類藥物產(chǎn)生耐藥的機制。體外實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中存在膽固醇血清時，伊曲康唑?qū)熐沟淖饔没钚越档蚚34]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉中，一種固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-SrbA可以通過erg11，cyp51A調(diào)節(jié)菌株對唑類藥物的耐藥性，而srbA的突變菌株(ΔsrbA)對氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)LC）和VRC表現(xiàn)出高度敏感[35]。

2 討論

近年流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曲霉菌感染率正呈逐年上升趨勢，再加上曲霉菌感染診斷率低，死亡率高的特點，對人類社會的健康造成了極大威脅[4-5]。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6,9]。其中，唑類藥物廣泛用于曲霉菌感染的預(yù)防、經(jīng)驗性治療以及慢性真菌感染的長期保守治療，其中VRC被推薦用作曲霉菌感染的一線治療方案[6-7,21]。但在過去的幾年間，世界各地均有煙曲霉對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性的報道，且報道數(shù)量仍在不斷增加，所以對曲霉菌進(jìn)行耐藥率和耐藥機制的研究就顯得尤為重要[9,21]。因此，對于以上情況，本文給與以下建議：由于抗菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模使用，使得每個國家都應(yīng)密切關(guān)注并調(diào)查最新耐藥株的流行情況，并依據(jù)調(diào)查結(jié)果在耐藥株發(fā)生率高的地區(qū)積極調(diào)整治療方案。實驗室則應(yīng)對臨床曲霉菌分離株進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗，以便臨床醫(yī)生選擇最佳的抗真菌治療方案。而對于正在進(jìn)行單唑類抗真菌藥物治療的患者，需進(jìn)行密切監(jiān)測，當(dāng)發(fā)現(xiàn)唑類耐藥、臨床治療失敗時，應(yīng)迅速調(diào)整新的治療方案，使之包括兩性霉素B，或在VRC中加入一種棘皮菌素?？偟膩碚f，有效的抗真菌管理對于控制耐藥性的產(chǎn)生至關(guān)重要，本文針對曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制的最新研究進(jìn)展作了簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監(jiān)測以及新型治療藥物作用靶點的研制提供理論基礎(chǔ)，但耐藥性的研究是項大工程，仍有許多機制不夠明確，需要人類進(jìn)一步探究。