渝東北地區(qū)441例白血病患者融合基因表達(dá)特點(diǎn)分析

孟凡萍，郝 坡

（1.重慶三峽中心醫(yī)院,重慶404000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,重慶400020）

白血?。╨eukemia）屬于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，是一組高度異質(zhì)性的惡性血液病，其特點(diǎn)為白血病細(xì)胞呈現(xiàn)異常增生伴分化成熟障礙。我國白血病發(fā)病率在3/10萬～5/10萬之間。世界衛(wèi)生組織在2008年就對造血組織腫瘤進(jìn)行了新的分類，依據(jù)是基因表達(dá)分析和新一代測序，作為鑒定骨髓腫瘤和急性白血病的新方法，這些分析和測序可以顯著改善診斷標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指證[1]。本研究采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(flurogenic quantitative reverse transcription-PCR,FQ-RT-PCR)對白血病43種融合基因(BCR-ABL,SIL-TAL1,E2A-HLF,TELAML1,MLL-AF4,E2A-PBX1,AML1-ETO,MLLAF9,PML-RARα,PLZF-RARα,STAT5b-RARα,MLL-AF6,MLL-AF10,MLL-ELL,MLL-ENL,NPMMLF1,TEL-PDGFRB,FIP1L1-PDGFRA,AML1-MDS1/EVI1,AML1-MTG16,CBFβ-MYH11,DEKCAN,TEL-ABL,ETV6-PDGFRA,NUP98-HoxA13,NUP98-HoxC11,NUP98-HoxD13,NUP98-HoxA9,NUP98-HoxA11,NUP98-PMX1,TELJAK2,MLL-AF17,MLL-AF1q,MLL-AF1p,MLLAFX,MLL-SEPT6.NPM-RARα,FIP1L1-RARα,PRKAR1A-RARα,NUMA1-RARα,NPMALK,SET-CAN,TLS-ERG）的篩查，數(shù)量龐大，幾乎覆蓋了白血病基因病變的50%以上，能很好地對渝東北地區(qū)白血病融合基因的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行篩查，有助于實(shí)現(xiàn)白血病早期診斷，指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇治療方案，并更好診斷微量殘留白血病。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月～2019年9月于本院就診的白血病患者441例，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，臨床資料完整，排除其他腫瘤，以及對本研究所涉及疾病有影響的其他疾病。

1.2 試劑和儀器 核酸提取試劑、RNA質(zhì)量檢測試劑、人類白血病43種融合基因檢測試劑盒（Fa-RT-PCR法）為上海源奇生物醫(yī)藥科技公司產(chǎn)品，紫外分光光度計購自美國life公司，熒光定量PCR儀COBAS Z480為德國Cbas公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集：髂后（髂前）上棘抽取骨髓2ml，用EDTA-K2抗凝，保存于Trizol中，低溫運(yùn)輸送檢。

1.3.2 RT-PCR

1.3.2.1 樣本處理：Trizol法提取RNA（按說明書操作）。

1.3.2.2 樣本濃度確定：將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用人體組織RNA質(zhì)量檢測試劑盒進(jìn)行濃度確定，內(nèi)參檢測Ct＜30時，方可進(jìn)入下一步擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.3 cDNA擴(kuò)增：43種融合基因引物分9份加入反應(yīng)管，再加入熒光探針、Taq酶、UNG酶以及PCR反應(yīng)所需的其他試劑，在CobasZ480熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：預(yù)變性42℃ 5min，94℃ 3min；PCR循環(huán)：94℃ 15s，60℃ 60s，40個循環(huán)，在60℃時收集熒光信號。檢測通道為FAM，CY5，VIC。

2 結(jié)果

2.1 441例患者43種融合基因的表達(dá)情況 通過對441例白血病患者的骨髓進(jìn)行43種融合基因的檢測，了解其融合基因的表達(dá)情況。檢測發(fā)現(xiàn)，其中193例患者有融合基因的表達(dá)，表達(dá)率為43.76%（193/441）。在193例有融合基因表達(dá)的患者中，融合基因BCR/ABL，AML-ETO，PMLRARa，MLL-AF9，CBFβ-MYH11的表達(dá)率分別為75.13%（145/193），8.29%（16/193），6.22%（12/193），4.15%（8/193）和2.59%（5/193），融合基因MLL-AF4，WT1和E2A-PBX1的表達(dá)率均為0.52%(1/193)，同時有MLL-AF6，MLLAF10，ELL和ENL四種融合基因同時表達(dá)的表達(dá)率為1.55%（3/193），WT1和PML-RARa兩種融合基因同時表達(dá)的表達(dá)率為0.52%（1/193），248例患者未檢出融合基因。

2.2 BCR/ABL亞型的表達(dá)情況 在BCR/ABL亞型中，表達(dá)P210的患者有139例，占95.86%，表達(dá)P190的患者僅有4例，占2.76%，而表達(dá)P230的患者只有2例，僅占1.38%。從以上亞型表達(dá)來看，在BCR/ABL亞型中以P210的表達(dá)最重要，故BCR-ABL-P210成為BCL/ABL融合基因檢測中的常用檢測指標(biāo)。

3 討論

白血病是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。研究表明，大部分白血病和淋巴瘤都存在染色體的突變，如染色體的易位、缺失和插入等。染色體的易位大部分情況下會生成融合基因。世界衛(wèi)生組織2008年發(fā)布的白血病和淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)已將染色體易位后融合基因檢測作為診斷白血病和淋巴瘤的最重要的檢測指標(biāo)之一，對融合基因的檢測分析有利于白血病和淋巴瘤治療方案的確定和預(yù)后判斷[1]。

融合基因是白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。通過檢測白血病融合基因，為急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）、慢性粒單核細(xì)胞性白血?。–MML）、骨髓增生異常綜合征等白血病類型的分子分型提供臨床參考，并對預(yù)后評估和個體化用藥提供指導(dǎo)。如BCR-ABL融合基因，可在95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病（CML）患者血液中檢出。PML-RARa（t15;17)(q21;q22）融合基因?yàn)榧毙栽缬琢＜?xì)胞白血病（APL）所特有[2]，PML-RARa 強(qiáng)陽性預(yù)示著有復(fù)發(fā)的可能，故患者的預(yù)后與融合基因的種類有重要關(guān)系。目前治療APL的方案是通過全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化，并且聯(lián)合應(yīng)用砷劑進(jìn)一步誘導(dǎo)這些異常細(xì)胞凋亡，這種治療方法預(yù)后非常好，復(fù)發(fā)率低，其他類型白血病或其他融合基因如MLL相關(guān)融合基因等則對于全反式維甲酸的治療不敏感、預(yù)后差，死亡率高[3-4]。

近年來，白血病融合基因的研究成為白血病發(fā)病機(jī)制和抗白血病研究的熱點(diǎn)，取得了一定成績，尤其是染色體易位后形成的融合基因已作為診斷不同類型白血病的分子標(biāo)志物和唯一確診依據(jù)，如急性髓細(xì)胞白血病AML-M4Eo：CBFβ/MYH11,inv(16)(p13;q22)；急性早幼粒細(xì)胞白血病APL：PML/RARa，t(15;17)(q21;q22)；慢性粒細(xì)胞白血病CML或部分急性淋巴細(xì)胞白血病ALL：BCR/ABL，t (9;22)(q34;q11)；AML-M4/M5：11q23MLL；ALL-L3：MYC/IgH，t(8;14) (q24;q32)；AML-M2：AML1/ETO，t(8;21)(q22;q22)。

白血病微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）是造成急性白血病復(fù)發(fā)的根源，是導(dǎo)致白血病病人治療后無法長期生存的關(guān)鍵。融合基因的檢測對MRD的監(jiān)測有重要意義[5]。目前有三種方法廣泛用于MRD的研究，分別是逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增融合基因、多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和PCR擴(kuò)增免疫球蛋白抗原受體重排或T細(xì)胞受體重排。RT-PCR技術(shù)比傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法更靈敏，靈敏度可達(dá)103～105(103～105細(xì)胞中有1個腫瘤細(xì)胞)以上，且可在臨床癥狀出現(xiàn)前5～8個月就能檢測到，故RT-PCR技術(shù)成為最常用的融合基因檢測技術(shù)[6-8]。張坤龍等[9]采用的多重RTPCR同時檢測兒童急性白血病29種常見的融合基因，可很好的進(jìn)行白血病的MICM分型和指導(dǎo)臨床個體化治療，具有覆蓋面廣、檢出率高、假陰性低等優(yōu)點(diǎn)。目前用于RT-PCR檢測的靶基因主要是白血病特異性染色體的易位產(chǎn)生的融合基因[10]，白血病患者體內(nèi)融合基因轉(zhuǎn)錄的拷貝數(shù)隨病情進(jìn)展而逐漸升高，隨病情好轉(zhuǎn)而逐漸下降，并且早于細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析。由此得出白血病融合基因的檢測對白血病的急性程度、克隆特性及分型、指導(dǎo)科學(xué)治療具有重要價值。定期檢測白血病微小殘留病很有必要。臨床上通過檢測微小殘留病融合基因表達(dá)水平，指導(dǎo)白血病的臨床治療，決定是否繼續(xù)化療，是否存在耐藥，并依此指導(dǎo)臨床更換治療方案，也可評價造血干細(xì)胞移植的凈化效果[11-12]。

本研究采用的FQ-RT-PCR技術(shù)具有高特異度、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的特點(diǎn)。對渝東北地區(qū)441例白血病患者骨髓標(biāo)本中的白血病相關(guān)融合基因的表達(dá)分析，結(jié)果有193例患者有融合基因表達(dá)，陽性率為43.76%，表達(dá)占前三位的融合基因分別是BCR/ABL,AML-ETO和PML-RARa，表達(dá)率分別為75.13%，8.29%和6.22%，而在BCR/ABL亞型中，P210陽性者最多，占95.71%。

本研究結(jié)果可在更大程度上更準(zhǔn)確地輔助渝東北地區(qū)白血病的臨床診斷并指導(dǎo)相關(guān)臨床用藥。白血病融合基因的檢測可早期診斷和治療白血病，不僅可以更多挽救患者生命，改善生存狀態(tài)，減輕患者家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。