綿羊肝臟、肺臟細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)差異蛋白質(zhì)表達(dá)分析

彭文軍，曹得萍，張耀剛，劉 燕，姜博璠，趙海龍

細(xì)粒棘球蚴病(囊型包蟲病)是細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲(棘球蚴)寄生于人及食草類動物和嚙齒類動物組織器官而引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病[1]。全國每年感染棘球蚴的家畜5 000 萬頭，造成近30億元的損失[2]。 細(xì)粒棘球蚴包囊可寄生在人體任何部位，以肝臟居多 (約占70%)，其次是肺(約占20%)，大腦、肌肉等其他部位約占10%[3]。細(xì)粒棘球絳蟲廣泛流行于青海省南部藏區(qū)，其棘球蚴對廣大農(nóng)牧民的身體健康和南部地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重影響[4-5]。前期研究[6-7]結(jié)果顯示人體棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液蛋白質(zhì)表達(dá)有差異，而且棘球蚴和泡球蚴組織蛋白質(zhì)表達(dá)也有差異。本研究利用iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)對綿羊肝臟及肺臟分離細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)(肝臟原頭節(jié)(hepatic protoscoleces, Hepatic_P)和肺臟原頭節(jié)(lung protoscoleces，Lung_P))進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析，尋找宿主不同寄生部位棘球蚴原頭節(jié)特異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，為研究調(diào)控細(xì)粒棘球蚴生長發(fā)育、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程蛋白質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。研究同一宿主不同寄生部位棘球蚴原頭節(jié)蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜特征對進(jìn)一步揭示其在同一宿主不同臟器寄生、增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 收集西寧市牛羊屠宰場感染棘球蚴的綿羊肝臟和肺臟，在實(shí)驗(yàn)室無菌狀態(tài)下分離棘球蚴囊壁、囊液、原頭節(jié)。原頭節(jié)用無菌生理鹽水漂洗3遍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2原頭節(jié)總蛋白質(zhì)制備和SDS電泳 本實(shí)驗(yàn)共收集4組肝臟和肺臟棘球蚴原頭節(jié)，每組原頭節(jié)樣品稱取0.05 g在液氮中將樣本研成粉末后轉(zhuǎn)至離心管中，加入裂解液(含1 mmol/L的PMSF、2 mmol/L的EDTA)混勻，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L的DTT，冰浴超聲5 min；25 000 g 4 ℃離心20 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入5倍體積冷丙酮沉淀過夜；25 000 g 4 ℃離心20 min，棄上清；加入1 mL冷丙酮，搗碎沉淀，置于-20 ℃ 30 min，25 000 g 4 ℃離心20 min，棄上清；風(fēng)干沉淀中殘余丙酮，加入適量裂解液，搗碎沉淀，混勻冰浴超聲5 min；25 000 g 4 ℃離心15 min，取上清用于定量。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)樣品上樣量30 μg，Marker上樣量10 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3蛋白質(zhì)酶解 每個(gè)樣品取出100 μg，按蛋白質(zhì)∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補(bǔ)加Trypsin 1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h。

1.4iTRAQ標(biāo)記 胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)后，用真空離心泵抽干肽段；用0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，分別用8標(biāo)iTRAQ 試劑中的 113、114、115、116、117、118、119和121等 4 個(gè)標(biāo)記分子進(jìn)行標(biāo)記 (具體操作參照試劑盒說明書) 后等量混合。每一組肽段被不同的iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2 h；將標(biāo)記后的各組肽段混合，用SCX柱進(jìn)行液相分離。

1.5基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析 將抽干的每個(gè)組分分別用buffer A (5% ACN, 0.1% FA) 復(fù)溶至約0.5 μg/μL的濃度，20 000 g離心10 min，除去不溶物質(zhì)。每個(gè)組分上樣5 μL(約2.5 μg蛋白)，通過島津公司LC-20AD型號的納升液相色譜儀進(jìn)行分離。

1.6蛋白數(shù)據(jù)庫搜索 采用Mascot 2.3.02蛋白質(zhì)鑒定軟件進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)庫搜索。

2 結(jié) 果

2.1各樣本蛋白質(zhì)提取濃度和提取量 提取的各組原頭節(jié)總蛋白質(zhì)經(jīng)Bradford定量，其原頭節(jié)蛋白質(zhì)濃度及得到的總蛋白質(zhì)量如表1所示，得到的各組蛋白質(zhì)量滿足SDS-PAGE及ITRAQ蛋白分析的用量。

表1 肝臟和肺臟各樣本原頭節(jié)蛋白質(zhì)濃度及提取量

2.2各樣本蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳膠圖 各原頭節(jié)樣本總蛋白質(zhì)行SES-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色后蛋白質(zhì)表達(dá)譜如圖1所示，各樣本蛋白質(zhì)條帶在35～45 kDa之間有差異，尤其是肝4的樣本大約在55 kDa處蛋白質(zhì)濃度高。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)記物；L-P表示肺臟原頭節(jié)；H-P表示肝臟原頭節(jié)；1、2、3、4表示第1組，第2組，第3組，第4組

2.3質(zhì)譜檢測結(jié)果 標(biāo)記好的肽段經(jīng) SCX 分離及 C18 除鹽后用 ESI-Q-TOF 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測方式：正離子，掃描范圍：50～3 000 m/z，利用 Mascot (http: //www.matrix science. com/search_form_select.html) 軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析，通過實(shí)驗(yàn)中所得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫比對得到蛋白質(zhì)定性及定量結(jié)果，共獲得與棘球絳蟲匹配的肽段1 229個(gè)，其中2段以上不同肽段覆蓋的蛋白266個(gè)，占全部鑒定蛋白的93.99%；5段以上不同肽段覆蓋蛋白179個(gè)，占全部鑒定蛋白的63.25%；10段以上不同肽段覆蓋的蛋白86個(gè)，占全部鑒定蛋白的30.39%，蛋白分離和鑒定結(jié)果均較好。這一結(jié)果表明采用iTRAQ試劑標(biāo)記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對寄生于青海省青南地區(qū)綿羊肝臟和肺臟細(xì)粒棘球絳蟲棘球蚴原頭節(jié)蛋白質(zhì)組的有效分離和鑒定，圖2為每組寄生于肝臟與肺臟原頭節(jié)的差異蛋白質(zhì)數(shù)量。

(紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào))

2.4生物信息學(xué)分析及功能注釋 實(shí)驗(yàn)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)wiff文件通過ProteinPilot 3.0軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫 (090303.fasta)，種屬選擇為sheep。使用Cluster3.0軟件進(jìn)行分層聚類分析蛋白的表達(dá)模式。本研究運(yùn)用集分析算法對初步鑒定的1 159個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，鑒定的蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選擇GO的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能注釋對蛋白質(zhì)進(jìn)行分類、注釋。參與免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)有141個(gè)，參與代謝的蛋白質(zhì)有441個(gè)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)有180個(gè)，還有一些蛋白質(zhì)參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期等，部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)如表2所示。

2.5蛋白質(zhì)功能聚類分析 通過GO注釋對蛋白功能進(jìn)行聚類分析，通過對寄生在綿羊肝臟和肺臟細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)差異蛋白進(jìn)行KEGG通路和GO分析對參與各類生物過程的1 229個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行富集度分析，結(jié)果顯示代謝相關(guān)蛋白質(zhì)以及應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架合成、基因表達(dá)翻譯和發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)在原頭節(jié)中顯著富集(圖3)，這些蛋白質(zhì)歸屬于5個(gè)生物過程，分別是：生物系統(tǒng)、新陳代謝、遺傳信息過程、環(huán)境信息過程和細(xì)胞系統(tǒng) (圖4)。

表2 部分綿羊肝臟及肺臟細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

圖3 顯示差異蛋白質(zhì)GO富集蛋白質(zhì)分布圖

圖4 蛋白質(zhì)KOG功能分類

3 討 論

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中有多種功能，它是細(xì)胞信號傳導(dǎo)、形態(tài)結(jié)構(gòu)維持、胞內(nèi)物質(zhì)代謝等生理功能的執(zhí)行者，搞清楚包蟲囊形成機(jī)制為包蟲病的防治帶來指導(dǎo)性作用。細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵進(jìn)入中間宿主后發(fā)育形成囊的過程是一個(gè)復(fù)雜的過程[8]，棘球蚴囊的形成過程：蟲卵-六鉤蚴-棘球蚴囊，六鉤蚴到底是怎么空泡化發(fā)育為囊泡，再形成由外向內(nèi)的角皮層、生發(fā)層及囊內(nèi)含物這是一個(gè)關(guān)鍵問題，此過程中必定有眾多的蛋白質(zhì)參與包蟲囊形成過程，也有蛋白質(zhì)參與了寄生蟲的免疫逃避等生物過程[9]。

付世強(qiáng)等[10]分析綿羊肝臟、肺臟細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)miRNA表達(dá)特征時(shí)發(fā)現(xiàn)在綿羊肝臟和肺臟分別有94條和88條miRNA 特異表達(dá)，這些特異表達(dá)的miRNA可能與棘球蚴的寄生部位不同有關(guān)。既然發(fā)現(xiàn)不同部位寄生原頭節(jié)表達(dá)的基因有差異，那么可以推測基因表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)也會有差異。Cui SJ等[11]運(yùn)用2D和LC-MS技術(shù)在綿羊肝臟細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)以及犬小腸內(nèi)成蟲共鑒定出1 610個(gè)蛋白質(zhì)，大部分是綁定蛋白和具有催化活性的蛋白質(zhì)，390個(gè)來自綿羊原頭節(jié)蛋白質(zhì)中至少有339個(gè)是新鑒定的。本研究運(yùn)用SDS-PAGE確定差異蛋白質(zhì)大約分布在35～55 kDa范圍之間，利用iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)對肝臟原頭節(jié)與肺臟原頭節(jié)的蛋白質(zhì)進(jìn)行ITRAQ蛋白質(zhì)組比較分析共分離鑒定出1 229個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了217個(gè)差異蛋白質(zhì)，74個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)在肝臟原頭節(jié)中上調(diào)，143個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)在肝臟原頭節(jié)中下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未鑒定的新蛋白質(zhì)，推測可能是原頭節(jié)在不同部位寄生時(shí)所處的環(huán)境不同導(dǎo)致其蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生不同。

本研究只是得到了綿羊肝、肺組織中棘球蚴原頭節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)譜，但靶蛋白的調(diào)控及靶蛋白與免疫應(yīng)答及蟲體的發(fā)育機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。本研究中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白是一個(gè)有意義的下調(diào)差異蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)質(zhì)量：24.5 kDa，有5個(gè)獨(dú)特肽，肝肺比值：0.35)，且眾多研究表明如肝癌[12]、脂肪肝[13]、肝炎[14]等肝臟疾病與鐵蛋白表達(dá)異常緊密相關(guān)，并且由于鐵蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特性，其已成為藥物治療的研究熱點(diǎn)之一。棘球蚴寄生在肝臟引起的肝包蟲病也是一種肝臟疾病，故研究鐵蛋白的功能及其在肝棘球蚴病中的作用機(jī)制，對預(yù)防和治療肝包蟲病有著極其重要的意義。后續(xù)研究將從鐵蛋白與棘球蚴的生長發(fā)育關(guān)系、鈣離子代謝、纖維化等方面進(jìn)行，希望能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)在綿羊肝臟和肺臟生長發(fā)育與鐵蛋白的相關(guān)性，為動物中間宿主包蟲病的分子防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

利益沖突：無