旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于小細胞肺癌H446細胞蛋白組分變化分析

李美辰，潘靖丹，范澤華，陳萬樓，陳彩鈴，吳合亮，李天歌，孫亞杰，杜孌英

在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，對人類的健康和生命產(chǎn)生了巨大威脅[1]。根據(jù)全球腫瘤登記中心報告表明，肺癌發(fā)病率位居全國發(fā)病率首位，每年發(fā)病人數(shù)約為78.1萬人。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計[2]，肺癌是最常見的癌癥，是癌癥死亡的主要原因。肺癌的病理類型分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。小細胞肺癌的惡性程度高于非小細胞肺癌，約占肺癌總數(shù)的14%左右[2]。旋毛蟲(Trichinellaspiralis)是一種人獸共患寄生蟲，據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲具有抑制腫瘤的作用。羅婧梅等[3]通過實驗證明，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins,ESPs)中含有抑制腫瘤生長的活性物質(zhì)，把肌幼蟲ESPs作用于小細胞肺癌H446后，能夠抑制其增殖，并誘導H446細胞發(fā)生凋亡。本實驗采用旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于小細胞肺癌H446細胞，通過質(zhì)譜法分析細胞內(nèi)蛋白組分的變化情況，進而觀察ESPs抑制小細胞肺癌H446增殖的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、蟲株及細胞株 7周齡，清潔級，雄性昆明小鼠，體重20～30 g，購自承德醫(yī)學院動物實驗中心。所用旋毛蟲為實驗室小鼠保種的豬源旋毛蟲。小細胞肺癌H446細胞株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2實驗試劑 胃蛋白酶購自北京奧博星生物科技有限責任公司，氯化鈉購自天津市百世化工有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，青鏈霉素購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.3旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白的獲取 小鼠經(jīng)口灌胃感染旋毛蟲300條，35 d后采用頸椎離斷法處死，取小鼠全部橫紋肌置于攪拌機中粉碎，加入鹽酸、胃蛋白酶，于37 ℃恒溫水浴鍋中消化3～4 h，通過改良貝氏法收集肌幼蟲，除去肉渣和纖維，用含500 U/mL鏈霉素、青霉素的生理鹽水洗滌沉淀數(shù)次，100目無菌銅網(wǎng)過濾、沉淀，收集獲得純凈的肌幼蟲。按4 000～5 000條的密度放置于含有青、鏈霉素的無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的孵箱中培育24 h，選擇培養(yǎng)基清澈，死蟲率低的培養(yǎng)皿，10 000 r/min，4 ℃離心30 min，小心吸取上清，即獲得干凈的旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4小細胞肺癌H446細胞的培養(yǎng) 取出本實驗室液氮保存的小細胞肺癌H446細胞，置于37 ℃溫水中緩慢融化，1 000 r/min，離心3 min后，棄掉凍存液，加入2 mL含有青鏈霉素和血清的RPMI1640培養(yǎng)基，混勻，加入培養(yǎng)皿中，補加至5 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞形態(tài)，更換培養(yǎng)基，待細胞長到培養(yǎng)皿的85%～90%，即可進行細胞傳代，經(jīng)過3次傳代后取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.5細胞總蛋白提取及SDS-PAGE分離 將處于對數(shù)生長期的小細胞肺癌H446細胞傳代至10 cm培養(yǎng)皿中，每日觀察細胞狀態(tài)，換液處理，待細胞長至85%～90%，把細胞分成實驗組和陰性對照組。實驗組加入0.85 mg/mL排泄分泌蛋白，對照組加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，分別作用24 h后，用PBS清洗細胞2次，用含0.25%胰酶消化細胞，收集細胞，按照細胞裂解液說明書，分別提取各皿中的細胞總蛋白，并進行蛋白濃度的測定。配制12%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，每孔上樣80 μg，電壓80V轉至120 V進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。凝膠用0.1%考馬斯亮藍R250染色液經(jīng)過4 h染色后用乙醇-冰醋酸脫色液進行脫色。脫至背景無色透明(圖1)。

1.6 質(zhì)譜鑒定和分析

1.6.1脫色 沿染色邊緣切下選定的含目的蛋白斑點的膠塊，切成1 mm小膠粒，100 mL含50%乙腈，50 mmol/L碳酸氫銨溶液浸泡脫色，棄去溶液，重復1～2遍至膠粒無色。

1.6.2還原烷基化 加50 μL乙腈脫水至膠粒變白，真空離心10 min干燥膠粒。加入25 mmol/L碳酸氫銨(含10 mmol DTT)50 μL，56 ℃水浴1h。冷卻至室溫后，吸干并快速加入50 μL 25 mmol/L碳酸氫銨(含55 mmol/L碘乙酰胺)，置暗室45 min。再用乙腈脫水10 min至膠粒變白，真空抽干10 min。

1.6.3酶解 在干燥膠顆粒中根據(jù)膠粒大小加入2～5 μL 10 ng/μL胰蛋白酶(溶于25 mmol/L碳酸氫銨)，加入適量25 mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37 ℃孵育過夜(16～18 h)。加入50 μL含0.1%甲酸和50%乙晴振蕩搖勻，60 min后離心收集酶解液，加入50 μL 100%乙腈振蕩搖勻，60 min后離心收集上清液，合并抽干，使用0.1% FA復溶用于后續(xù)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。1.6.4LC-MS/MS檢測 液相色譜條件：色譜柱：Acclaim PePmap 100，C18富集柱(75 μm×20 mm，3 μm顆粒)；分析柱：自制一體柱，柱料：Venusil×BPC，C18(L)5 μm，150A(艾杰爾)(規(guī)格75 μm×150 mm，顆粒)。流速400 nL/min；流動相A：含0.1%甲酸水溶液；流動相B：含0.1%甲酸乙腈；質(zhì)譜條件：離子化方式：納升電噴霧正離子(ESI+)；數(shù)據(jù)采集模式：DDA方式，每次掃描中20個強度最高的離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析；離子源電壓：1 800 V；毛細管溫度：360 ℃；采集范圍：MS 350～2 000 m/z，二級掃描范圍依賴于一級母離子質(zhì)荷比自動選擇。

2 結 果

2.1質(zhì)譜分析鑒定結果 質(zhì)譜分析實驗組共含有240種蛋白質(zhì)，其中的204種為已明確鑒定的蛋白質(zhì)，22種為未明確鑒定的蛋白質(zhì)，14種為假定蛋白質(zhì)。從已知的204種蛋白質(zhì)中檢索出1種與抗腫瘤相關的蛋白質(zhì)即組蛋白H2A(histone H2A)。質(zhì)譜分析對照組共含有233種蛋白質(zhì)，其中195種為已明確鑒定的蛋白質(zhì)，21種為未明確鑒定的蛋白質(zhì)，17種為假定蛋白質(zhì)。其中實驗組和對照組的重合蛋白質(zhì)為191種，實驗組和對照組的非重合蛋白質(zhì)為49種(表1)，對照組和實驗組的非重合蛋白質(zhì)為42種。240種蛋白均可以在Uniport網(wǎng)站上查詢。

表1 ESPs組和對照組非重合蛋白

2.2蛋白功能富集分析 根據(jù)Gene Ontology 生物信息學分類，細胞組分分析發(fā)現(xiàn)，在實驗組多于對照組的已鑒定的49種蛋白質(zhì)中，屬于細胞器組分的占59.2%(29/49)、屬于細胞質(zhì)組分的占51%(25/49)、屬于細胞核組分的占32.7%(16/49)(表2)。

表2 已明確鑒定的蛋白質(zhì)GO細胞組分、分子功能及生物過程分類

分子功能富集分析顯示，這49種蛋白共具有142種分子功能，其中大部分參與結合、催化活性、核苷酸結合過程，還參與了DNA結合、水解酶活性等過程，所占比例較小的蛋白質(zhì)參與了磷酸酶活化、連接酶活化等過程，如具有催化活性的占44.9 %(22/ 49)，參與核苷酸合成過程的占39%(19/49)，參與DNA結合過程的占10.2%(5/49)，參與磷酸酶活化過程的占4.1%(5/49)等。生物過程的分析結果表明，鑒定的蛋白質(zhì)共參與了743種生物過程，大部分參與生物過程調(diào)節(jié)、多細胞生物發(fā)展過程，還參與了有機質(zhì)代謝過程、細胞大分子代謝等過程，所占比例較小的蛋白參與了DNA 構象變化過程、凋亡過程、細胞通信調(diào)節(jié)等過程。

3 討 論

旋毛蟲是一種毛型科毛型種的寄生蟲，其成蟲寄生于哺乳動物腸道內(nèi)，其幼蟲寄生于橫紋肌細胞內(nèi)，是一種人獸共患的寄生蟲[3]。為了適應其發(fā)育過程中不同的生活環(huán)境，旋毛蟲蟲體在不同發(fā)育階段分泌不同的蛋白質(zhì)，稱為排泄分泌蛋白或排泄分泌抗原。流行病學調(diào)查和實驗室研究證明旋毛蟲對抑制腫瘤生長有積極或消極作用[4]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲的有效蛋白具有抑制腫瘤的作用，旋毛蟲能夠抑制肺癌[5]、白血病[6]、黑色素瘤[7]、肝癌[8]等惡性腫瘤。旋毛蟲肌幼蟲ESPs是通過提取旋毛蟲肌幼蟲，將其置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時吸取上清獲得的。課題組常紅敏[9]前期實驗發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠抑制小細胞肺癌H446細胞的增殖，進一步研究旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠誘導H446細胞發(fā)生凋亡，后期研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠觸發(fā)線粒體凋亡通路誘導H446細胞發(fā)生凋亡，然而，ESPs是一種復雜的混合物，到底是哪些蛋白起了抑制腫瘤細胞的增殖作用以及作用的可能機制并不明確。因此，我們進行了此項實驗，把旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細胞，與對照組相比，通過質(zhì)譜法觀察細胞組分的變化。LC-MS/MS是一種準確度高，分離范圍廣的快速分離方法，它對化合物的結構破壞性小，適合有機分子和生物分子的分離。質(zhì)譜具有其他分析方法無可比擬的靈敏度，對于未知化合物的結構分析定性十分準確，對相應的標準樣品要求也比較低。

本文用LC-MS/MS質(zhì)譜法分析了旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于小細胞肺癌H446細胞的全部蛋白的組分。和對照組比較，實驗組多出蛋白組分49種，對這49種蛋白質(zhì)進行GO分析，發(fā)現(xiàn)這49種蛋白具有催化活性等142種分子功能，參與代謝過程、胚胎發(fā)育、應激反應、生物調(diào)節(jié)等743種生物過程(表2)。課題組Luo JM等[10]運用LC-MS/MS技術發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲ESPs中有6種與抗腫瘤相關的蛋白質(zhì)。但旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細胞后，從實驗組細胞中只鑒定出H2A一種。推斷組蛋白H2A可能通過某種方式進入了細胞里，對于旋毛蟲肌幼蟲ESPs抗腫瘤發(fā)揮了重要作用。

組蛋白是由H2A、H2B、H3、H4構成的組蛋白八聚體，位于真核細胞染色體基本單位—核小體中[11]。王蓓莉等[12]對討論核心組蛋白H2A在乳腺癌組織中的表達以及乳腺癌患者預后生物因素進行分析，發(fā)現(xiàn)TNM分期越早，H2A表達越高，低表達的H2A常提示TNM分期晚，H2A的低表達提示更低的生存率，可能提示H2A有抑制腫瘤的作用。Mir AR等[13]發(fā)現(xiàn)，糖氧化修飾組蛋白H2A與其他糖化蛋白和核酸產(chǎn)生交叉反應，在癌癥患者中形成了高特異性抗體，可能提示H2A有抑制癌癥的作用。王蓓莉等[11]研究發(fā)現(xiàn)H2AX是組蛋白H2A的一種變體，被認為是一種新的抑癌蛋白。 Balicki D等[14]發(fā)現(xiàn)瞬時轉染了組蛋白H2A的scIL-12 細胞因子能有效誘導抗腫瘤免疫反應。

實驗組和對照組的重合蛋白質(zhì)為191種，非重合蛋白質(zhì)分別有49種和42種，說明旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細胞后，除去檢出抗腫瘤成分H2A外，細胞內(nèi)蛋白組分也發(fā)生了明顯而復雜的變化，作者推測旋毛蟲肌幼蟲ESPs抗腫瘤不是H2A單獨作用的結果，可能是多種物質(zhì)綜合作用的結果，作用過程復雜。

利益沖突：無