KOD DNA聚合酶熒光PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

黃明翔，陳新朝，陳曉紅，方美蘭

據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)告，結(jié)核病仍是危害人類健康的重大疾病，是全球十大死亡原因之一。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，結(jié)核病病例居世界第2位，防治形勢(shì)嚴(yán)峻[1]。結(jié)核病的早期診斷對(duì)及時(shí)治療患者，控制其傳播具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)涂片顯微鏡檢查陽(yáng)性率低且不能區(qū)分陽(yáng)性菌是結(jié)核還是非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosisMycobacterium，NTM)，而培養(yǎng)需要3～8周的時(shí)間不能滿足快速診斷的要求。近年來，興起的分子生物學(xué)方法具有快速、敏感性高等特點(diǎn)，多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于結(jié)核病診斷，并成為結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[2]。

本研究使用的PCR熒光探針檢測(cè)試劑盒是針對(duì)MTB的DNA J基因設(shè)計(jì)2條特異性引物，通過KOD DNA聚合酶采用熒光探針Q Probe對(duì)樣本中的結(jié)核分枝桿菌相應(yīng)的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。DNA J基因是Hsp40(熱休克蛋白)的成員之一，控制熱休克σ因子32，已用于包括軍團(tuán)菌、葡萄球菌、鏈球菌等多種細(xì)菌研究[3]。KOD DNA聚合酶來源于超嗜熱古菌(ThermococcusKodakaraensis)，與臨床常用PCR反應(yīng)體系的Taq DNA聚合酶比較，它的合成速度是Taq DNA聚合酶的2.5倍[4]，因此具有很高的檢測(cè)效率。但因?yàn)镵OD DNA聚合酶具有很高的DNA延長(zhǎng)能力以及過強(qiáng)的3′-5′核苷酸外切酶活性，所以其在PCR中很難控制，國(guó)內(nèi)有少部分高校科研院所在使用KOD DNA聚合酶開發(fā)產(chǎn)品，但截至目前為止，國(guó)內(nèi)外還沒有相關(guān)技術(shù)在結(jié)核病診斷應(yīng)用的報(bào)道。本研究旨在通過應(yīng)用該方法檢測(cè)臨床結(jié)核病疑似患者痰樣本，以臨床診斷為參照，MGIT960液體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，基于Taq DNA聚合酶熒光PCR為對(duì)照方法，探討KOD DNA聚合酶熒光PCR在結(jié)核病快速診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年10月至2020年4月在我院結(jié)核科住院的具有肺結(jié)核癥狀、體征的疑似肺結(jié)核病患者作為研究對(duì)象，收集患者痰標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色、MGIT960液體培養(yǎng)、KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)及Taq DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)。

1.2臨床診斷及隨訪 臨床醫(yī)生根據(jù)患者的痰涂片結(jié)果、影像學(xué)診斷結(jié)果(胸片或CT)和臨床檢查結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行初步診斷，對(duì)于確診肺結(jié)核患者進(jìn)行抗結(jié)核治療。2個(gè)月后對(duì)KOD DNA聚合酶的熒光PCR檢測(cè)陰性排除肺結(jié)核患者進(jìn)行隨訪，以確認(rèn)最終診斷結(jié)果。

1.3主要儀器與試劑 BACTEC MGIT960液體培養(yǎng)儀及配套試劑，美國(guó)BD公司；TCG-D1全自動(dòng)核酸提純及定量熒光PCR分析系統(tǒng)，日本東洋紡株式會(huì)社；ABI7500全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Life Technologies Holdings Pte Ltd?？顾崛旧嘿?gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；商品化配套試劑盒包括：聚合酶試劑[KOD Mix]、引物MTB F：5′-ACGGCGCTGAGTTCAACCTCAACG-3′、反向引物MTB R：5′-GAACAAGCCACCGAACAAGTCACCGAT-3′、Q探針: 5′-CGAACCGGCGGTACCAC-3′，以上試劑購(gòu)自日本東洋紡株式會(huì)社； Taq DNA聚合酶熒光PCR法選用中山大學(xué)達(dá)安基因試劑。

1.4 研究方法

1.4.1倫理情況 本試驗(yàn)通過福州結(jié)核病防治院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：2018-008(科研)-01)。

1.4.2臨床診斷 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]，以患者的出院診斷作為臨床診斷結(jié)果。

1.4.3痰涂片抗酸染色檢查 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]。

1.4.4MGIT960液體培養(yǎng)法 嚴(yán)格按照BACTEC MGIT960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行培養(yǎng)，吸取約5 mL(不超過10 mL)痰液加入帶有螺旋帽的50 mL離心管中，加入與標(biāo)本等量的NaOH-NALC前處理液，振蕩消化15 min，加入40 mL pH6.8磷酸緩沖液(PBS)，3 000 g離心15 min，棄上清，加入1～2 mL PBS(pH6.8)，以制備成懸濁液，0.5 mL接種至準(zhǔn)備好的MGIT培養(yǎng)管進(jìn)行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果由儀器自動(dòng)報(bào)告陽(yáng)性后，進(jìn)行抗酸涂片和菌種鑒定。

1.4.5菌種鑒定方法 應(yīng)用PNB和TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行初步菌種鑒定，PNB不生長(zhǎng)TCH生長(zhǎng)鑒定為MTB，PNB、TCH均生長(zhǎng)鑒定為NTM[6]。

1.4.6Taq DNA聚合酶熒光PCR 取1 mL痰液中加入4倍體積的4%氫氧化鈉搖勻，室溫下液化30 min，取0.5 mL至1.5 mL離心管中，再加入0.5 mL 4% 氫氧化鈉搖勻，室溫放置10 min后15 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加1 mL無菌生理鹽水打勻，15 000 r/min 離心5 min，再重復(fù)洗滌1次，沉淀直接加50 μL DNA提取液充分混勻，100 ℃水浴10 min，轉(zhuǎn)至4 ℃靜置6～8 h以保證充分裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL做PCR反應(yīng)。陽(yáng)性判斷：Ct值<30實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4.7KOD DNA聚合酶熒光PCR 取100 μL的樣品與等量溶解吸附液到研磨管進(jìn)行混合，80 ℃下加熱 10 min進(jìn)行滅菌，將研磨管置于漩渦振蕩器上振蕩 20 次，加入 800 μL溶解吸附液，13 000 g，離心 3 min，取 170 μL上清液到試劑分裝盒，封上鋁箔紙， 放置試劑分裝盒到儀器里，按全自動(dòng)分析系統(tǒng)操作說明書操作。熔解曲線熒光峰值大于≥10。

1.4.8PCR擴(kuò)增條件設(shè)置 見表1。

表1 兩種方法PCR擴(kuò)增條件

1.5采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 用kappa檢驗(yàn)驗(yàn)證2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。Kappa≥0.75表示二者一致性較好；95%CI均采用“正態(tài)近似法”進(jìn)行計(jì)算；兩種方法結(jié)果差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1病例入選及診斷類型 共收集344例，其中肺結(jié)核疑似患者237例，排除12例出院診斷不明確及7例經(jīng)培養(yǎng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌感染患者，納入最后結(jié)果分析的臨床診斷結(jié)核病有效病例為218例，非肺結(jié)核患者107例。

2.2入選病例基本情況 入選病例中臨床診斷為肺結(jié)核患者218例，非肺結(jié)核患者107例。其中，男性236例(72.6%)，女性89例(27.4%)；<20歲患者20例(6.2%)，≥20歲65例(20.0%)，40～歲119例(36.6%)，60～歲121例(37.2%)。具體情況見表2。

表2 納入樣本人群信息

2.3抗酸桿菌涂片結(jié)果 218例肺結(jié)核患者中涂片陽(yáng)性84例(38.53%)，涂片陰性134例(61.47%)。

2.4兩種不同DNA聚合酶熒光PCR結(jié)果比較 在納入統(tǒng)計(jì)有效樣本325例中，KOD DNA聚合酶法和Taq DNA聚合酶法陽(yáng)性符合率為92.94% (95%CI：89.09%～96.79%)，陰性符合率為94.19% (95%CI：90.51%～97.88%)，總符合率 93.54% (95%CI：90.87%～96.21%)。兩種檢測(cè)方法比較，Kappa=0.871>0.75，檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性，見表3。

表3 兩種熒光PCR結(jié)果比較

2.5KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.1以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)效能，并與結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)、Taq DNA聚合酶熒光PCR進(jìn)行比較 在臨床診斷的肺結(jié)核患者中，MGIT960液體培養(yǎng)、Taq DNA聚合酶熒光PCR、KOD DNA聚合酶熒光PCR的敏感度分別為71.56%、76.15%、76.61%，KOD DNA聚合酶熒光PCR與MGIT960液體培養(yǎng)檢測(cè)敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.445，P=0.229>0.05)，見表4。

表4 與臨床診斷結(jié)果比較，MGIT960培養(yǎng)及兩種熒光PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.2以液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能 收集的344份痰樣本中有7例培養(yǎng)陽(yáng)性，菌種經(jīng)PNB法鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，兩種PCR熒光探針法檢測(cè)均為陰性。為便于討論將這7例排除，另有12例診斷不明也被排除，共325例病例納入統(tǒng)計(jì)分析。以MGIT960液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)MTB敏感度為92.31%(144/156)和特異度為86.39% (146/169)；在237例涂片陰性患者中，敏感度和特異度分別為 84.21%(64/76)和88.48%(146/165)，見表5。

表5 與MGIT960液體培養(yǎng)比較，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.3兩種熒光PCR與細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)肺結(jié)核病例結(jié)果比較 在涂陽(yáng)、培養(yǎng)陽(yáng)性、及任一種細(xì)菌學(xué)方法陽(yáng)性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為100%、92.31%、92.50%，Taq DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為100%、89.74%、90.00%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.628、0.626,均P>0.05)；在涂陰、培養(yǎng)陰性、及兩種細(xì)菌學(xué)方法均為陰性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為61.90%、37.10%、32.76%，Taq DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為61.10%、41.94%、37.93%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16、0.304、0.340,均P>0.05)，見表6。

3 討 論

結(jié)核病的早期診斷對(duì)于病人獲得及時(shí)治療和疫情的防控具有十分重要的意義。近年來興起的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為我國(guó)結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，并作為肺結(jié)核診斷依據(jù)之一[5]。PCR熒光探針法是目前國(guó)內(nèi)結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室使用最為廣泛的分子生物學(xué)方法之一，而其中又以TaqMan熒光探針法最為常見[7]。該方法檢測(cè)快速、靈敏，但也存在易污染、操作復(fù)雜、對(duì)人員和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高等缺點(diǎn)。

本研究應(yīng)用的PCR 熒光探針法采用的是 KOD DNA聚合酶，該酶具有熱穩(wěn)定性好、DNA合成速度快、合成錯(cuò)誤率低的特點(diǎn)，與Tag DNA聚合酶比較，該酶在95 ℃可穩(wěn)定12 h，而Tag DNA聚合酶只能穩(wěn)定1.6 h；在DNA合成速率和錯(cuò)誤率方面，KOD DNA聚合酶為100 bp/s，錯(cuò)誤率僅為0.1%，Tag DNA聚合酶為54 bp/s，錯(cuò)誤率為4.8%，采用KOD DNA聚合酶，可以使1次循環(huán)的時(shí)間從原來的幾分鐘縮短為幾十秒[8-9]。本研究中PCR使用QProbe為探針，QProbe通過混合特定的排列，將具有熒光消失這一特征的熒光色素作為標(biāo)識(shí)的探針。利用這一特征，就無需使用插入DNA嵌入劑等其它雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的色素，也無需使用會(huì)引起FRET現(xiàn)象的2種探針，而是使用在一種熒光物質(zhì)中作出標(biāo)識(shí)的探針，在不會(huì)阻礙高速擴(kuò)增的同時(shí)，能夠特異性地檢測(cè)出目標(biāo)核酸排列[10]。另外，本研究PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因?yàn)镈NA J基因。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的目標(biāo)基因主要有插入序列IS6110(inSertion sequence 6110，IS6110)、16S核糖體RNA基因(16s ribosomal RNA，16srRNA)等。有研究發(fā)現(xiàn)亞洲地區(qū)流行的部分MTB菌株中，IS6110拷貝數(shù)較少或無此插入序列[11]，這可能導(dǎo)致檢測(cè)陽(yáng)性率降低；另有研究發(fā)現(xiàn)一些NTM菌種存在與IS6110具有同源性的基因片段，如龜分枝桿菌(M.chelonae)[12]，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。16SrRNA基因在多達(dá)100余種的分枝桿菌屬(Mycobacterium)中也存在交叉反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果。DNA J基因菌種特異性高，國(guó)外研究表明應(yīng)用該基因檢測(cè)MTB不會(huì)與不同種類分枝桿菌產(chǎn)生交差反應(yīng)，具有較好的靈敏度和特異度[4]。

本研究同時(shí)使用MGIT960液體培養(yǎng)法、Taq DNA聚合酶熒光PCR和KOD DNA聚合酶熒光PCR熒光探針法3種方法檢測(cè)肺結(jié)核疑似患者的痰樣本，結(jié)果顯示兩種熒光PCR檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性(Kappa=0.871>0.75)。由表3結(jié)果可見，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，3種檢測(cè)方法的Kappa值在0.624～0.683之間，均接近較好水平，而其中KOD DNA聚合酶熒光PCR的一致性最好。在檢測(cè)敏感度方面，KOD DNA聚合酶熒光PCR達(dá)到76.61%，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的熒光PCR70.4% 的檢測(cè)敏感度相近[13]，研究結(jié)果顯示本法敏感度遠(yuǎn)高于涂片鏡檢(38.53%)，與液體培養(yǎng)法無差別(P=0.229>0.05)，雖然理論上PCR的敏感度應(yīng)高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，但國(guó)內(nèi)外均有PCR法敏感度與培養(yǎng)法無差別的報(bào)道[14-15]，這可能與PCR試劑設(shè)計(jì)的檢測(cè)敏感度及痰中存在PCR抑制因子在結(jié)核菌量低時(shí)影響檢出率有關(guān)[16]；在特異度方面KOD DNA聚合酶熒光PCR達(dá)到100%，未納入統(tǒng)計(jì)的7例NTM標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果也均為陰性，顯示該方法選用的目標(biāo)基因DNA J基因具有較好的種屬特異性。表5結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)敏感度和特異度分別為92.31%和86.39%，特別在涂陰患者中敏感度達(dá)到84.21%，略高于Hida等[17]人報(bào)道的敏感度(72.7%)。另外，本研究顯示在涂片陰性、培養(yǎng)陰性和雙陰性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR的陽(yáng)性率分別達(dá)到了61.90%、37.10%、32.76%，該結(jié)果表明KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)MTB 的高靈敏度極大提高了肺結(jié)核尤其是菌陰肺結(jié)核的檢出率，為結(jié)核病的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本研究方法配套使用的PCR分析系統(tǒng)具有全自動(dòng)核酸提取及定量熒光PCR分析的功能，且系統(tǒng)為全封閉式。與傳統(tǒng)熒光定量PCR法相比，該方法全過程僅需60 min大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，相較于世衛(wèi)組織推薦的Genexpert系統(tǒng)也快了近1倍[18]。

本方法操作簡(jiǎn)便，標(biāo)本僅需NALC-NaOH處理后即可上機(jī)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作熟練度要求低，同時(shí)全封閉系統(tǒng)極大降低了生物安全和實(shí)驗(yàn)污染風(fēng)險(xiǎn)，不需要對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行分區(qū)。但本法尚不能檢測(cè)耐藥基因，是今后需要改進(jìn)的地方。綜上，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測(cè)MTB具有敏感度高、特異度高、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合各級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室開展。

利益沖突：無