崇明老白酒產(chǎn)地溯源判別

劉 星 張其才 姚春霞 宋衛(wèi)國

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403)

崇明老白酒已有700多年的釀造史，并于2007年被定為國家地理標志產(chǎn)品、2009年被列入上海非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄。崇明特殊的地理位置(四面環(huán)水)和日照充足、雨水充沛、空氣濕度常年保持在80%的氣候環(huán)境，為老白酒的釀造提供了適宜的環(huán)境，也給予了老白酒特定的風(fēng)味[1]。不同產(chǎn)地米酒由于所用原料(糯米、水)等不同及生產(chǎn)工藝存在差別，其口感存在差異，但外觀一般差異不大，消費者很難識別其產(chǎn)地的真假。隨著食品跨地區(qū)流通頻繁，具有特定品質(zhì)與文化特色的地理標志產(chǎn)品正被不法商家為謀取利益而假冒，消費者的合法權(quán)益和被仿冒品牌的知名度、美譽度等均受到了不良影響[2-3]。

常用的溯源技術(shù)包括信息溯源[4]和穩(wěn)定同位素[5]、多元素[6]、有機成分[7]、光譜[8]等分析技術(shù)的檢測溯源。信息溯源技術(shù)(二維碼、條形碼等)應(yīng)用較為普遍，但2018年“有機蔬菜假冒”事件證明信息溯源具有局限性[9]。食品中穩(wěn)定同位素自然豐度能客觀反映食品自身屬性與其生產(chǎn)環(huán)節(jié)自然信息(氣候、環(huán)境等)的關(guān)聯(lián)，已經(jīng)在大米、小麥、葡萄酒、果汁、蔬菜、肉類等食品的產(chǎn)地溯源判別中廣泛應(yīng)用[10]；礦物元素組成和含量受所在產(chǎn)地地質(zhì)、水、土壤等因素影響，不同產(chǎn)地的食品中礦物元素含量也是存在差異的，尤其是具有產(chǎn)地特征的Sr[11-12]；有機成分含量受所在產(chǎn)地溫濕度、日照、降雨、土壤等影響，不同產(chǎn)地的食品中氨基酸、糖類、脂類、酸、醇、活性成分等種類和含量也會存在差異[11]；光譜技術(shù)主要反映食品中有機成分的組成、含量、結(jié)構(gòu)和功能團等特征[13]，因此，這幾種溯源技術(shù)均可以依據(jù)不同的目標食品實現(xiàn)產(chǎn)地溯源判別，且已在葡萄酒[14]、白酒[15]、啤酒[16]、黃酒[17]等酒類的產(chǎn)地溯源中應(yīng)用。Wu等[14]基于穩(wěn)定同位素(δ13C、δ2H 和δ18O)和多元素(5種常量元素和11種微量元素)對來自法國、西班牙、意大利、澳大利亞、美國、南非、智利和中國的葡萄酒進行產(chǎn)地溯源判別，準確率超過90%；Song等[15]利用二維氣相色譜—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對4個產(chǎn)地的醬香型白酒(瀘州老窖、五糧液、洋河、古井貢酒)進行非靶向和靶向代謝組學(xué)分類，結(jié)果可以很好地將4個產(chǎn)地的白酒加以區(qū)分，且確定了特征風(fēng)味化合物為酸類、酯類、呋喃類、醇類、硫化物、吡嗪類等；Alcázar等[16]通過測定啤酒中多元素、氯化物、磷酸鹽、硫酸鹽、氨基酸、多酚和pH值，對德國、葡萄牙和西班牙三地的啤酒進行溯源判別，準確率達99.3%；Shen等[17]利用近紅外光譜技術(shù)判別紹興黃酒、福建黃酒和非紹興黃酒，其準確率超過97%。但是上述溯源技術(shù)在米酒產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用還未見報道。

研究擬以上海崇明老白酒為主要對象，選取其他產(chǎn)地有代表性的米酒作對照，依據(jù)不同產(chǎn)地米酒釀造過程所用水、糯米中各化學(xué)組分和含量的差異，應(yīng)用氫氧穩(wěn)定同位素自然豐度、礦物元素及游離氨基酸含量，與化學(xué)計量學(xué)方法結(jié)合，建立判別崇明老白酒的模型，篩選識別崇明老白酒的特征變量，為崇明老白酒的溯源提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

同位素比質(zhì)譜儀：MAT253 Plus型，美國Thermofisher公司；

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀：iCAP 6300型，美國ThermoFisher公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8900型，日本Hitachi公司；

分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電熱板：JH404型，上海錦凱科學(xué)儀器有限公司；

超純水儀：Ultra型，上海首立實業(yè)有限公司；

渦旋儀：MX-S型，美國賽洛捷克公司；

高速離心機：Microfuge 20R型，美國貝克曼公司。

1.1.2 主要試劑

穩(wěn)定同位素標準物質(zhì)VSMOW2水標準品(δ2H=0‰，δ18O=0‰)、SLAP2水標準品(δ2H=-427.5‰，δ18O=-55.5‰)和Low Natural Water(WA100)標準品(δ2H=-157.12‰，δ18O=-19.64‰)：奧地利國際原子能機構(gòu)；

疏水鉑催化劑：美國ThermoFisher公司；

礦物元素混合標準儲備溶液及內(nèi)標溶液：美國SPEX CertiPrep公司；

游離氨基酸標準溶液：日本Hitachi公司；

茚三酮、硝酸、高氯酸、鹽酸、乙醇、三氯乙酸、雙氧水等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 2017—2018年共采集有代表性的米酒樣品44個。其中，上海崇明老白酒32個，全部來自于上海市崇明區(qū)當?shù)厣a(chǎn)廠家；其他產(chǎn)地米酒樣品12個，分別為浙江省紹興市(2個)、湖北省孝感市(5個)、北京市(2個)及韓國進口米酒(3個)。用于崇明老白酒的產(chǎn)地特征分析與溯源判別模型建立。

1.2.2 米酒中氫氧穩(wěn)定同位素的測定 將每瓶(500 mL)米酒混合均勻后取500 μL于12 mL樣品瓶中加入鉑催化棒后擰緊瓶蓋，置于28 ℃的恒溫樣品盤，色譜柱溫度60 ℃，充入2%的H2+He混合氣，流速100 mL/min，吹掃5 min，平衡40 min，測定同位素分餾平衡后的H2同位素比值，用國際標準水樣校正測量米酒樣品的氫同位素。取500 μL米酒于12 mL樣品瓶，擰緊瓶蓋，置于25 ℃恒溫樣品盤，色譜柱溫度25 ℃，充入0.3% CO2+He混合氣，流速100 mL/min，吹掃5 min，平衡24 h，測定同位素分餾平衡后的CO2同位素比值，用國際標準水樣校正測量米酒樣品的氧同位素組成。

穩(wěn)定同位素比率計算是將已知同位素比率的標準品作為參照，計算未知樣本的穩(wěn)定同位素比率的相對值。計算公式：

(1)

式中：

X——穩(wěn)定同位素比率的相對值，‰

R樣品——所測樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即2H/1H和18O/16O；

R標準——國際標準樣品中重同位素與輕同位素的豐度比。

測試數(shù)據(jù)采用ISODAT 3.0軟件(美國Thermo-Fisher公司)處理，該試驗由上海交通大學(xué)分析測試中心所完成。

1.2.3 米酒中礦物元素和游離氨基酸的測定 按照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》方法測定米酒中的常量礦物元素(K、Na、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn和Zn)和具有產(chǎn)地特征的Sr[12]，由于Fe含量很低，并未測出；游離氨基酸天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、伽馬氨基丁酸(g-ABA)、鳥氨酸(Orn)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的測定，取適量米酒與5%的三氯乙酸(V米酒∶V三氯乙酸=1∶1)混勻，離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液，再按照GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》中方法用氨基酸分析儀測定，由上海交通大學(xué)分析測試中心所完成。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析和模型建立 文中數(shù)據(jù)是至少2次平行試驗的平均值，并用Matlab軟件(R2009a 美國 Mathworks公司)進行不同產(chǎn)地米酒中δ2H、δ18O、礦物元素和游離氨基酸的單尾方差分析，P<0.05表明統(tǒng)計學(xué)上差異顯著。將δ2H、δ18O、礦物元素和游離氨基酸含量與無監(jiān)督算法主成分分析(principal component analysis，PCA)和有監(jiān)督算法偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)方法結(jié)合，建立崇明老白酒產(chǎn)地判別模型，由SIMCA軟件(14.1 瑞典Umetrics公司)完成[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定同位素、礦物元素和游離氨基酸含量的特征

上海崇明老白酒和其他產(chǎn)地米酒中δ2H和δ18O值、礦物元素及游離氨基酸含量見表1、2。紹興米酒有最高的δ2H均值(-9.5‰)，崇明老白酒(-17.4‰)、孝感米酒(-30.6‰)、韓國米酒(-37.6‰)次之，北京米酒的δ2H值(-40.8‰)最貧化，這可能歸因于“崇明老白酒”及其他產(chǎn)地米酒釀造所用水是不同的，不同來源的水中δ2H和δ18O值是隨著緯度增加、距海洋距離增加、溫度降低等而逐漸貧化；紹興米酒有最高的δ18O值(-6.6‰)，但上海、孝感、韓國和北京米酒的δ18O值并沒有呈現(xiàn)與緯度相反的關(guān)系，高低順序為：紹興>北京>孝感>上海>韓國，可能歸因于米酒中δ18O值不僅受到水中氧穩(wěn)定同位素的影響，還可能受到釀造的糯米中δ18O值影響[19]53-55。盡管上海和紹興米酒的δ2H值與孝感、韓國和北京米酒的δ2H值在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著(P<0.05)，紹興和孝感米酒的δ18O值與上海和韓國米酒的δ18O值、北京米酒的δ18O值與韓國米酒的δ18O值在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著(P<0.05)，但是上海和紹興米酒之間的δ2H值、上海與韓國及北京米酒間的δ18O值在統(tǒng)計學(xué)上差異并不顯著(P>0.05)。同時，由表1可知，上海、紹興和韓國米酒的Ca含量與孝感和北京米酒的Ca含量在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著(P<0.05)，上海和北京米酒的Mn含量與孝感米酒的Mn含量在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著(P<0.05)，但是“崇明老白酒”的Ca含量與紹興和韓國米酒的Ca含量、上海米酒的Mn含量與紹興、韓國和北京米酒的Mn含量以及其他6種礦物元素在不同米酒中的含量在統(tǒng)計學(xué)上差異均不顯著(P>0.05)，可能是崇明老白酒釀造所用糯米和水的產(chǎn)地與其他產(chǎn)地米酒所用的不同，即使均為崇明生產(chǎn)的米酒，由于崇明地區(qū)四面環(huán)水的特殊地形[1]，也使得其所產(chǎn)大米和水中礦物元素含量不同，且同一產(chǎn)地米酒所用大米也可能來自外地，從而使得同一產(chǎn)地米酒中的礦物元素含量差異較大，進而導(dǎo)致同一產(chǎn)地礦物元素的標準偏差很大，與其他產(chǎn)地含量的差異在統(tǒng)計學(xué)上不顯著。因此，僅通過δ2H值、δ18O值和常量礦物元素含量還不能將上海崇明米酒與其他產(chǎn)地的米酒完全區(qū)分。

由表2可知，“崇明老白酒”含有最高的Trp含量(4.70 μg/kg)，孝感米酒中g(shù)-ABA含量(24.03 μg/kg)最高，韓國米酒中Asp(31.86 μg/kg)、Thr(14.00 μg/kg)、Ser(19.24 μg/kg)、Glu(86.58 μg/kg)、Gly(39.83 μg/kg)、Ala(133.03 μg/kg)、Cys(9.79 μg/kg)、Orn(30.70 μg/kg)、

表1 不同產(chǎn)地米酒的氫氧穩(wěn)定同位素和礦物元素含量?

表2 不同產(chǎn)地米酒的游離氨基酸含量?

Lys(62.10 μg/kg)、His(24.19 μg/kg)、Arg(131.40 μg/kg)和Pro(54.34 μg/kg)含量最高，北京米酒中Val(36.98 μg/kg)、Met(9.81 μg/kg)、Ile(23.09 μg/kg)、Leu(65.63 μg/kg)、Tyr(45.03 μg/kg)和Phe(63.57 μg/kg)含量最高，紹興米酒中所有20種游離氨基酸的均值最低。由方差分析結(jié)果可知，所有游離氨基酸含量雖然在不同產(chǎn)地米酒中的數(shù)值存在較大差別，但由于標準偏差大使得其均值在統(tǒng)計學(xué)上差異并不顯著(P>0.05)，這一現(xiàn)象的原因同礦物元素，主要歸因于米酒釀造所用的糯米產(chǎn)地不同。因此，需要利用可以綜合單個米酒樣品中各考察變量信息的PCA和PLS-DA來構(gòu)建崇明老白酒判別模型。

2.2 崇明老白酒的PCA溯源判別

不同產(chǎn)地米酒的PCA得分圖及載荷變量圖見圖1。除2個其他產(chǎn)地米酒[1個韓國米酒(箭頭所指)和1個北京米酒(箭頭所指)]與上海崇明老白酒相重疊，其余米酒基本上可以被區(qū)分開[圖1(a)]，說明PCA可以初步實現(xiàn)“崇明老白酒”與其他產(chǎn)地米酒的判別。由圖1(b)可知，對第1主成分[對原變量解釋能力(R2X)為0.598]影響大的變量主要為Asp、Leu、Val、Gly、Met等，對第2主成分影響大的變量主要為Mn、δ2H、δ18O、Zn、Ca、Mg、K等，這些變量在崇明老白酒產(chǎn)地判別中有重要作用。但由圖1 也可知，即使均產(chǎn)自崇明島的老白酒，由于地理、氣候環(huán)境等差異大，也會使米酒中氫氧同位素自然豐度、礦物元素和游離氨基酸含量存在差別[圖1(a)中正方形所標樣品]，而不同產(chǎn)地米酒會因釀造所用原料中各組分差異的綜合而使得其與崇明老白酒難以區(qū)分[19]177-182。由于PCA為無監(jiān)督算法，無法正確判別組間差異不明顯的樣本[17]，不能將崇明老白酒與其他產(chǎn)地米酒進行完全區(qū)分。因此，需要運用有監(jiān)督的算法PLS-DA來進一步提高崇明老白酒產(chǎn)地判別的正確率。

2.3 PLS-DA溯源判別及特征變量篩選

米酒的PLS-DA主成分數(shù)、主成分數(shù)對原變量的解釋能力(R2X)和模型溯源判別正確率見表3，影響模型判別結(jié)果的重要變量(VIP)見圖2(a)。結(jié)果表明，第1主成分對原變量的解釋能力為0.090 3，VIP>1的變量順序為δ2H>Sr>Arg>Mn>Cu>Zn>Ca>δ18O，利用第1主成分能將30個上海崇明老白酒與其他地方米酒溯源(正確率為88.64%)，其他產(chǎn)地米酒有3個被錯判為上海崇明老白酒。

圖1 PCA得分及載荷變量圖

當增加1個主成分時，VIP>1的變量數(shù)沒有增加，前兩個主成分對原變量的解釋能力累計為0.644，仍有2個上海崇明老白酒樣品被判錯為其他產(chǎn)地米酒，其他產(chǎn)地也有3個樣品被錯判為上海崇明老白酒(正確率仍為88.64%)。通過PLS-DA前兩個主成分得分圖[圖2(b)]也可以看出有2個上海崇明老白酒與其他產(chǎn)地米酒聚集在一起(箭頭所指)。當主成分數(shù)增加到6時，模型對原變量的解釋能力累計為0.809，VIP變量無新增加，崇明老白酒判別正確率為100%，其他產(chǎn)地米酒有1個被錯判為上海崇明老白酒，模型總的判別正確率為97.73%。主成分繼續(xù)增加并沒有使模型的正確率提高，因此，最終選擇前6個主成分來建模。

由于前6個主成分建模所用的變量相同，由圖2(a)可知，VIP >1的變量排序為δ2H>Sr>Arg>Mn>Cu>Zn>Ca>δ18O，δ2H值在崇明老白酒產(chǎn)地溯源中起最重要的作用，證明了自然地理環(huán)境影響的水源中氫穩(wěn)定同位素對米酒產(chǎn)地溯源的重要性[10][19]53-55。對溯源模型的重要性也可以由變量在不同產(chǎn)地米酒中的系數(shù)值來反映[20]，見圖3。上述8個變量在米酒中的系數(shù)值均為絕對值靠前的變量，說明這8個變量對于崇明老白酒的產(chǎn)地判別有重要作用。基于這8個變量重新構(gòu)建PLS-DA模型，當主成分為3時可得最佳判別模型(總正確率95.45%)，見表4，僅有2個崇明老白酒被判錯(正確率93.75%)，外地米酒完全正確溯源，說明這8個變量基本可以代表米酒所有變量信息，可以作為上海崇明老白酒產(chǎn)地判別的特征變量。

表3 PLS-DA模型結(jié)果

圖2 PLS-DA第1個主成分的VIP圖及前兩個主成分得分

圖3 PLS-DA模型中第1主成分在不同產(chǎn)地米酒中的變量系數(shù)

表4 基于特征變量建立的PLS-DA模型結(jié)果

3 結(jié)論

借助δ2H、δ18O、礦物元素和游離氨基酸對上海崇明老白酒與其他產(chǎn)地米酒進行產(chǎn)地判別及產(chǎn)地特征變量篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA不能實現(xiàn)所有上海崇明老白酒的產(chǎn)地溯源，而PLS-DA最優(yōu)模型對上海崇明老白酒的產(chǎn)地判別正確率達100%，此時選取了8個變量為崇明老白酒產(chǎn)地判別的特征變量。試驗所選米酒樣品均為中國市場具有產(chǎn)地代表性的產(chǎn)品，所用建模方法為經(jīng)典的化學(xué)計量學(xué)方法，因此，所得模型穩(wěn)健性較高，可以用于中國主要產(chǎn)地米酒的溯源判別。但因其他產(chǎn)地米酒產(chǎn)量不高，所采集到樣品數(shù)有限，后續(xù)需不斷增加其他產(chǎn)地米酒數(shù)量來提高產(chǎn)地溯源判別模型的適用性。