姜黃素對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯致昆明小鼠腎損傷的保護(hù)作用*

梁馮，晏彪

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，武漢 430065；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，咸寧 437100)

姜黃素(curcumin，Cur)是一種具有抗氧化能力的自由基清除劑，可減輕腎臟肥大，減少系膜基質(zhì)擴(kuò)張；同時(shí)還對(duì)糖尿病腎病、腎缺血等急慢性腎臟疾病具有改善作用[1-2]。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)作為主要塑化劑之一，能以不同的濃度浸入PVC醫(yī)療器械存儲(chǔ)的溶液中，臨床上某些人群包括透析患者和孕婦的血液或尿液，可能長(zhǎng)期暴露于DBP[3]。流行病學(xué)研究顯示[4]，DBP及其代謝物與腎臟的一系列不良反應(yīng)存在相關(guān)性，毒理學(xué)研究也證實(shí)DBP具有潛在的腎毒性[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)Cur 對(duì)DBP暴露后KM小鼠腎組織氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及血清中肌酐(creatinine，Crea)和尿素氮(urea-nitrogen，Urea)含量的影響，探究Cur的潛在作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 3周齡SPF級(jí)雄性昆明(KM)小鼠28只，體質(zhì)量(17±1) g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0052]。小鼠飼養(yǎng)動(dòng)物房溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜交替12 h，自由攝食、飲水。

1.2藥品與試劑 Cur(Sigma公司，含量≥98.0%，批號(hào)：08511)，DBP(Sigma公司，含量≥99.6%，批號(hào)：84742)，小鼠血清Urea、Crea試劑盒(深圳市庫(kù)貝爾生物科技有限公司，批號(hào)：11.01.0105)，總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A015-2)，半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3，Casp-3)試劑盒(BioVision公司，批號(hào)：K106-25)。Western blotting一抗：均為兔抗小鼠，β-actin(天德悅公司，批號(hào)TDY051，5%脫脂牛奶，1：10 000)，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)(CST公司，批號(hào)：4695，5%BSA，1：2000)，磷酸化ERK(p-ERK)(CST公司，批號(hào)4370，5%BSA，1：1000)；二抗：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體(ASPEN公司，批號(hào)：AS1107，5%脫脂牛奶，1：10 000)。免疫組化一抗：兔抗Bcl-2(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：ba0412)、Bax(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：ba0315)，二抗：羊抗兔IgG抗體、兔IgG過(guò)氧化物酶標(biāo)記的生物素復(fù)合物(SABC-POD)及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。

1.3儀器與設(shè)備 iMagic-M7全自動(dòng)生化分析儀(深圳市庫(kù)貝爾生物科技有限公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(英國(guó)Syngene)，RM2245切片機(jī)(德國(guó)Leica)，顯微鏡BX53 (日本Olympus)。

1.4動(dòng)物分組及給藥 28只KM小鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組、暴露組(50 mg·kg-1DBP，DBP組)、給藥組(2.5 mg·kg-1Cur)、暴露+給藥組(50 mg·kg-1DBP+2.5 mg·kg-1Cur，DBP+Cur)，每組7只。DBP 的暴露劑量參照YAN等[6]設(shè)置為50 mg·kg-1，暴露途徑為口腔灌胃；Cur的給藥劑量參考ALCANTARA 等[7]選擇為2.5 mg·kg-1，腹腔注射給藥；DBP+Cur組中Cur先腹腔注射給藥，2 h后再口腔灌胃DBP，實(shí)驗(yàn)鼠給藥體積均為10 mL·kg-1，實(shí)驗(yàn)周期28 d。

1.5測(cè)量指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)4周結(jié)束后，小鼠經(jīng)心臟取血，采用小動(dòng)物全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組小鼠的腎功能指標(biāo)Urea、Crea。處死小鼠后，取約1.5 g的腎組織加預(yù)冷的PBS制成10%勻漿液，4 ℃，10 000×g離心10 min后取上清液，用于自由基(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及T-AOC水平的檢測(cè)。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)熒光定量分析腎組織勻漿中ROS水平[8-9]；硫代巴比妥酸法(TBARS)測(cè)定腎組織勻漿中MDA含量，蛋白質(zhì)含量用Folin酚法測(cè)定，MDA含量(μmol·mg-1)=[6.45(A532-A600)-0.56×A600](μmol·L-1)×樣本稀釋倍數(shù)/待測(cè)勻漿蛋白濃度(mg·mL-1)；用試劑盒測(cè)定腎組織勻漿中T-AOC水平，ELISA試劑盒測(cè)定Casp-3水平。Western blotting檢測(cè)各組小鼠腎組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況，采集β-actin、ERK1/2及p-ERK1/2條帶，以β-actin作內(nèi)參，分別得到各樣品ERK1/2、p-ERK1/2與β-actin的灰度比值。對(duì)各組小鼠腎組織切片進(jìn)行免疫組化染色，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0版軟件測(cè)定平均光密度值(以非染色區(qū)域?yàn)閷?duì)照)，分析Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠腎功能指標(biāo)的變化 各組小鼠血清Urea、Crea含量的變化，見(jiàn)圖1。DBP組Urea、Crea含量顯著高于對(duì)照組(t=3.99，4.98，P<0.01)；與DBP組相比，DBP+Cur組Urea含量顯著降低(t=-4.19，P<0.01)，Crea含量有一定程度地降低。

2.2各組小鼠腎組織氧化應(yīng)激及Casp-3水平的變化 由圖2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，DBP組小鼠腎組織ROS、MDA、Casp-3水平顯著增加(t=12.60，P<0.01)(t=2.81，P<0.05)(t=8.84，P<0.01或P<0.05)，T-AOC水平顯著性降低(t=-2.66，P<0.05)；與DBP組比較，DBP+Cur組小鼠腎組織ROS、Casp-3水平均有顯著性降低(t=-5.08，-7.54，P<0.01)，T-AOC水平顯著上升(t= 2.75，P<0.05)。

2.3各組小鼠腎組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，DBP組小鼠腎組織p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(t=14.21，P<0.01)；與DBP組比較，DBP+Cur組p-ERK蛋白表達(dá)水平有一定程度下調(diào)；各組小鼠腎組織ERK表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖3。

1.正常對(duì)照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與DBP組比較，P<0.01。

2.4各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 鏡下觀察，腎組織細(xì)胞核被染上了藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)則顯示黃色(強(qiáng)陽(yáng)性的地方呈現(xiàn)棕黃色)，Bcl-2、Bax均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，見(jiàn)圖4A。DBP組小鼠腎組織中Bax的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(t=11.33，P<0.01)；經(jīng)Cur處理后，與DBP組比較，DBP+Cur組Bcl-2和Bax的比值顯著上升(t=4.43，P<0.05)，見(jiàn)圖4B。

3 討論

DBP是一種廣泛使用的增塑劑，可通過(guò)消化道、皮膚及醫(yī)療器械接觸等多種途徑進(jìn)入人體，有數(shù)據(jù)顯示DBP及其代謝物在特殊人群尿液中的檢出率已超過(guò)90%[3]。輸血所用的PVC血袋釋放的DBP可以在人體的多個(gè)器官中積聚，DBP的殘留將可能?chē)?yán)重影響輸血者的生殖、發(fā)育、免疫等系統(tǒng)[8]。以往的研究指出，DBP是一種過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(PPARs)誘導(dǎo)劑，DBP介導(dǎo)的PPARs激活被認(rèn)為是DBP引起肝腎毒性的主要機(jī)制之一[9]。事實(shí)上，DBP造成人類(lèi)出現(xiàn)肝腎毒性的途徑可能不是由PPARs介導(dǎo)的；相反，PPARs的非依賴調(diào)節(jié)機(jī)制可能參與了這一過(guò)程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，DBP還可作為一種外源性氧化物，刺激機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，活化ERK蛋白，甚至影響B(tài)ax、Bcl-2的比值以及Casp-3水平，從而導(dǎo)致腎功能出現(xiàn)障礙或異常。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cur給藥處理后，DBP暴露組小鼠腎組織的氧化應(yīng)激水平及促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)下降，血清中Crea、Urea水平趨于正常，以上結(jié)果提示，Cur對(duì)DBP所致的腎損傷有一定的保護(hù)作用。

1.正常對(duì)照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與正常對(duì)照組比較，P<0.05；③與DBP組比較，P<0.01，④與DBP組比較，P<0.05。

1.正常對(duì)照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01。

1.正常對(duì)照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與DBP組比較，P<0.05。

1.normal control group；2.DBP group；3.Cur group；4.DBP+Cur group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with DBP group，P<0.05.

Fig.4 Immunohistochemical staining (A) and mean optical density analysis (B) on renal tissue of four groups of mice(×200)

Crea、Urea是反映腎功能的兩個(gè)重要指標(biāo)，血清Crea的顯著升高則提示腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙，正常情況下，血清Crea水平能準(zhǔn)確反映腎實(shí)質(zhì)損害，血清Crea值偏高，大多意味著腎臟受損。腎實(shí)質(zhì)損傷時(shí)腎小球重吸收減少，血清Urea水平也會(huì)相應(yīng)升高[10]。尿素是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝的主要終產(chǎn)物，血清中尿素濃度主要受腎功能的影響。尿素排泄能力越強(qiáng)，腎功能狀態(tài)越好；反之，如果尿素排泄能力不足，這可能表明腎功能受損。結(jié)果表明，DBP組小鼠血清Crea和Urea水平明顯升高，提示DBP對(duì)小鼠腎細(xì)胞有嚴(yán)重的損傷作用，但給予Cur處理后，Crea和Urea水平明顯下降。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了DBP可以顯著提高腎組織ROS的水平，而ROS的積聚會(huì)改變細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)使MDA含量增加，同時(shí)降低抗氧化能力，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的組織損傷。此外，在氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的ROS作為上游信號(hào)分子參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，最終導(dǎo)致病理改變和器官功能障礙[11]。Cur具有抗氧化活性，經(jīng)處理Cur后，DBP暴露后小鼠腎組織ROS、MDA水平下調(diào)，以及抗氧化能力得到提高。結(jié)果表明，氧化應(yīng)激參與了DBP所致的腎功能障礙或異常，Cur可通過(guò)阻斷ROS的過(guò)量產(chǎn)生而發(fā)揮保護(hù)作用。

文獻(xiàn)[12]表明ERK及其磷酸化在腎相關(guān)疾病中可能發(fā)揮重要的作用。一些研究也指出，ERK的過(guò)度激活參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[13]。ERK是真核生物中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，ERK信號(hào)途徑也是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路。LEE等[14]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可由ERK1/2磷酸化介導(dǎo)，ERK1/2通路被刺激信號(hào)激活，磷酸化激活的ERK1/2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，介導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和其他生物學(xué)功能。已有研究表明[15]，DBP的同系物鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)作為細(xì)胞外信號(hào)可以激活p38MAPK引起相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后生物學(xué)效應(yīng)。因此，DBP引起的腎功能障礙可能與ERK通路的激活有關(guān)。結(jié)果表明，DBP組小鼠腎組織磷酸化ERK的總體水平高于對(duì)照組；相反，給予Cur處理后，DBP+Cur組ERK水平趨于降低，以保護(hù)腎組織的損傷。

目前Bcl-2是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子，Caps-3是凋亡過(guò)程中的執(zhí)行分子[16]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，如果Bax相對(duì)量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡；而如果Bcl-2相對(duì)量高于Bax，則促進(jìn)形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，DBP組小鼠腎組織中Bax、Bcl-2水平均有升高，但Bax相對(duì)量更高，提示有促凋亡的趨勢(shì)，這與沈華等[17]報(bào)道DBP孕期暴露導(dǎo)致子代大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的觀察結(jié)果一致。給予Cur處理后，DBP+Cur組Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，提示Cur具有抑制凋亡的作用。

綜上所述，姜黃素對(duì)DBP所致小鼠腎損傷的保護(hù)作用，或與其可阻斷DBP誘導(dǎo)的自由基形成有關(guān)，另一方面，Cur的保護(hù)作用還可能與抑制細(xì)胞凋亡途徑的p-ERK、Bax以及Casp-3高表達(dá)相關(guān)。鑒于Cur藥理作用的復(fù)雜性，對(duì)DBP引起的腎損傷的保護(hù)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。