miR-127靶向驅動蛋白KIF3B調控肺鱗癌紫杉醇藥物敏感性的研究

丁旭萍，張丹紅，陳 影*

0 引言

近年來，隨著腫瘤精準醫(yī)療的深入發(fā)展，對于腫瘤生物學特性和基因的深入理解越來越受到眾多學者的高度重視，成為分子靶向藥物和放化療增敏劑開發(fā)的“敲門磚”。其中miRNAs在腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、化療耐藥等過程中發(fā)揮重要作用[1]。肺鱗癌(Squamous cell lung cancer，SQCLC)是非小細胞肺癌中的常見類型，由于早期癥狀不典型，很多患者確診時已進展至中晚期，因此化療選擇必不可少[2]，但是80%以上的患者會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，從而導致治療失敗或預后不良[3]。紫杉醇是肺鱗癌患者最重要的化療藥物之一，通過促進細胞內微管蛋白聚合并抑制其解聚，從而誘導細胞周期阻滯，抑制有絲分裂，達到促使腫瘤細胞凋亡的目的[4]。驅動蛋白Kinesin家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)是定位于腫瘤細胞中心紡錘體、調控后期紡錘體運動和胞質分裂的關鍵分子之一[5]。生物信息學分析結果顯示，KIF3B可能是miR-127的靶基因，因此本研究旨在證實miR-127和KIF3B在肺鱗癌細胞中的表達變化和相關性，并分析上調miR-127表達對肺鱗癌細胞紫杉醇敏感性的影響及可能的作用機制，從而為提高肺鱗癌患者對紫杉醇的臨床獲益提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺鱗癌細胞系NCI-H520、NCI-H226以及正常永生化肺上皮細胞BEAS-2B購自美國菌種保藏中心。人肺鱗癌細胞系SK-MES-1購自中國科學院上海細胞庫。所有細胞凍存在本實驗室的液氮中，復蘇后接種于DMEM完全培養(yǎng)基(90%DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+100U/mL青-鏈雙抗)中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)購自美國Cell Signaling Technology公司，貨號：#9807，純度>99.5%(HPLC)，保存于-20 ℃。用前將1 mg PTX溶于1.15 ml二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中，配制成1 mmol/L PTX儲備液，置于-20 ℃條件下保存。

杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、Trizol試劑購自美國ThermoFisher公司；逆轉錄試劑盒、TaqMan?MicroRNA Assays、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉染試劑和噻唑藍(MTT)試劑購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI_雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；miR-127模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)購自上海生工生物工程有限公司；pcDNA3.1購自上海慕遠公司；KIF3B兔源多克隆抗體和HRP標記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測各細胞中miR-127和KIF3B mRNA表達 采用Trizol法提取1×108個細胞總RNA，Trizol試劑提取細胞總RNA，將RNA樣本溶解分裝后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，合成cDNA。并將逆轉錄產(chǎn)物進行PCR擴增，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列匯總表

1.2.2 人肺鱗癌PTX耐藥細胞株SK-MES-1/PTX的建立 收集對數(shù)期生長的SK-MES-1細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，采用梯度濃度遞增法建立SK-MES-1/PTX耐藥細胞株。首先加入0.1 nmol/L誘導劑量PTX，培養(yǎng)2～3周后，依次遞增PTX作用終濃度：0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 nmol/L，每個梯度濃度培養(yǎng)2～3周。經(jīng)過6個月的誘導期，獲得可在20 nmol/L PTX濃度下穩(wěn)定生長的耐藥細胞株SK-MES-1/PTX。

1.2.3 細胞轉染和分組 取生長狀態(tài)良好的SK-MES-1/PTX細胞，調整細胞濃度1×105/ml，提前1 d在備行轉染的6孔板上接種1 ml，常規(guī)培養(yǎng)，24 h后更換為Opti-MEM培養(yǎng)基。配制轉染試劑-DNA質粒復合物(取3 μl稀釋后的LipofectamineTM2 000試劑加入至已稀釋好的100 μl DNA質粒中，混勻后，室溫孵育20 min)。將轉染試劑-DNA質粒復合物加入至細胞中，完全覆蓋細胞，分別介導轉染miR-127 mimics、pcDNA-KIF3B質?；蚩召|粒(miR-NC)。37 ℃轉染48 h，取出觀察細胞形態(tài)。并采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中miR-127和KIF3B表達量。根據(jù)轉染情況，將SK-MES-1/PTX細胞分為空白(對照)組、陰性(對照)組、miR-127 mimics組和miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗 通過YearthBio構建KIF3B-3′UTR野生型序列，并插入pGL3熒光素酶載體中構建KIF3B-3′UTR-WT質粒，另采用Easy Mutagenesis System 構建KIF3B-3′UTR突變序列，插入pGL3熒光素酶載體中構建KIF3B-3′UTR-MUT質粒。將表達載體pcDNA-EGFP-pre-miR-127或空質粒分別與KIF3B-3′UTR-WT質?；騅IF3B-3′UTR-MUT質粒共轉染至SK-MES-1/PTX細胞中。轉染48 h后，采用Promega GloMaxTM20/20 發(fā)光檢測儀檢測熒光素酶活性。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的SK-MES-1細胞或SK-MES-1/PTX細胞，調整細胞濃度1×104/ml，按100 μl/孔單層接種至96孔板中，24 h貼壁后更換為含藥培養(yǎng)基。SK-MES-1細胞培養(yǎng)板中PTX終濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L；SK-MES-1/PTX細胞培養(yǎng)板中PTX終濃度分別為10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0、2 000.0 nmol/L，每組設置8個復孔。作用48 h后，采用MTT法檢測吸收波長為490 nm處的吸光光度值(A值)，根據(jù)公式A計算細胞增殖抑制率(%)并繪制劑量-效應曲線。計算細胞對PTX的半數(shù)抑制濃度(50% inhibition concentration，IC50)。根據(jù)公式B計算耐藥指數(shù)。

公式A：細胞增殖抑制率(%)=[1-(A實驗組-A空白組)]/A空白組×100%

公式B：細胞耐藥指數(shù)(RI)=SK-MES-1/PTX細胞IC50/SK-MES-1細胞IC50

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將各組SK-MES-1/PTX細胞經(jīng)100 nmol/L PTX處理48 h后，收集各組細胞約1×107/ml，采用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒進行染色，采用流式細胞儀檢測。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測KIF3B蛋白表達量 收集生長狀態(tài)良好的SK-MES-1細胞或SK-MES-1/PTX細胞，約1×107個，加入RIPA細胞裂解液冰浴裂解，提取細胞總蛋白；Baradford法檢測蛋白濃度。取2 μg蛋白樣品變性后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳；聚偏二氟乙烯轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗(KIF3B抗體1∶500稀釋，一抗孵育完后需回收)孵育過夜；即用型二抗孵育1 h；ECL顯影；用成像系統(tǒng)掃描靶條帶的灰度值，并用內參GAPDH校正誤差。

2 結果

2.1 人肺鱗癌細胞系NCI-H520、NCI-H226、SK-MES-1和人正常永生化肺上皮細胞BEAS-2B中miR-127和KIF3B蛋白的表達差異 如圖1所示，經(jīng)實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測，與BEAS-2B細胞相比，NCI-H520、NCI-H226、SK-MES-1細胞中miR-127表達量降低(圖1A)，KIF3B蛋白表達量升高(圖1B、圖1C)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 人肺鱗癌細胞系NCI-H520、NCI-H226、SK-MES-1和人正常永生化肺上皮細胞BEAS-2B中miR-127(A)和KIF3B蛋白(B&C)的表達差異

2.2 SK-MES-1/PTX耐藥細胞株的建立及驗證 經(jīng)過6個月的誘導期，成功建立可在20 nmol/L PTX濃度下穩(wěn)定生長的耐藥細胞株SK-MES-1/PTX。如圖2所示，經(jīng)MTT法檢測，隨著PTX作用濃度增加，對SK-MES-1細胞和SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率逐漸增加。相同PTX濃度條件下，PTX對SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率低于SK-MES-1細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PTX抑制SK-MES-1細胞和SK-MES-1/PTX細胞增殖的IC50分別為(19.02±1.13)nmol/L和(180.65±4.85)nmol/L。SK-MES-1/PTX細胞對PTX的耐藥指數(shù)為(9.50±0.64)。

圖2 不同劑量對SK-MES-1細胞和SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率(n=8)注：與相同濃度條件下SK-MES-1細胞增殖抑制率比較，*P<0.05

2.3 SK-MES-1/PTX耐藥細胞中miR-127和KIF3B蛋白表達 如圖3所示，經(jīng)實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測，與SK-MES-1細胞相比，SK-MES-1/PTX細胞中miR-127表達量降低(圖3A)，KIF3B蛋白表達量升高(圖3B、圖3C)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 SK-MES-1/PTX耐藥細胞和親本細胞SK-MES-1中miR-127(A)和KIF3B蛋白(B&C)的表達差異

2.4 雙熒光素酶基因報告分析 根據(jù)TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預測，KIF3B可能是miR-127的下游靶基因。如圖4所示，將KIF3B-3′-UTR-WT質粒和miR-127 mimics共轉染之后，熒光酶活性減弱，與KIF3B-3′-UTR-WT質粒和NC-mimics共轉染組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而將KIF3B-3′-UTR-MUT質粒和miR-127 mimics共轉染之后，熒光酶活性幾乎無變化。

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-127和KIF3B基因的靶向調控關系注：與miR-NC組相比，*P<0.05

2.5 SK-MES-1/PTX耐藥細胞轉染效果驗證 如圖5所示，經(jīng)實時熒光定量PCR法檢測，與空白組和陰性組相比，miR-127 mimics組SK-MES-1/PTX細胞中miR-127表達量升高(圖5A)，而miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組KIF3B mRNA表達量亦升高(圖5B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 各組SK-MES-1/PTX細胞miR-127(A)和KIF3B mRNA(B)相對表達量

2.6 各組SK-MES-1/PTX耐藥細胞對PTX的敏感性

2.6.1 MTT法檢測PTX對各組細胞增殖抑制情況 如圖6所示，經(jīng)MTT法檢測，隨著PTX作用濃度增加，對各組SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率逐漸增加。相同PTX濃度條件下，PTX對miR-127 mimics組SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率最高，而對miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組細胞增殖的抑制率最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PTX抑制miR-127 mimics組和miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組SK-MES-1/PTX細胞增殖的IC50分別為(115.35±10.94)nmol/L和(220.47±15.86)nmol/L，對PTX的耐藥指數(shù)分別為(6.06±0.58)和(11.59±1.28)。

圖6 不同劑量對各組SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率(n=8)

2.6.2 流式細胞術檢測PTX對各組細胞凋亡的影響 如圖7所示，100 nmol/L PTX作用于空白組、陰性組、miR-127 mimics組和miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組SK-MES-1/PTX細胞48 h后，細胞凋亡率分別為(14.50%±2.33%)、(16.12%±3.24%)、(33.69%±5.48%)、(15.72%±2.67%)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miR-127 mimics組SK-MES-1/PTX細胞凋亡率較空白組增加，而miR-127 mimics+pcDNA-KIF3B組SK-MES-1/PTX細胞凋亡率較miR-127 mimics組降低。

圖7 經(jīng)流式細胞術檢測PTX對各組SK-MES-1/PTX細胞凋亡的影響

3 討論

肺鱗癌耐藥表型的形成是一個涉及多因素、多步驟、多階段的復雜過程，包括關鍵基因發(fā)生遺傳學或表觀遺傳學改變、相關信號通路的激活、腫瘤細胞損傷后自我修復能力增強等[6]，miRNAs在各個環(huán)節(jié)的上游都發(fā)揮著關鍵作用。因此，眾多miRNAs不僅是預測肺癌化療藥物敏感性的潛力指標，而且miRNAs類似物或抑制劑還有望成為臨床提高化療藥物敏感性的精準醫(yī)療手段之一。

人類miR-127位于染色體14q32.31，該區(qū)域屬于DLK/GTL2的印跡區(qū)域，在多種腫瘤細胞中表達量下調，包括非小細胞肺癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]等。因此，我們推測miR-127在部分組織癌變過程中可能發(fā)揮著抑癌基因的活性。在本研究中，通過實時熒光定量PCR法檢測也證實，人肺鱗癌細胞系NCI-H520、NCI-H226、SK-MES-1中miR-127的表達量低于人正常永生化肺上皮細胞BEAS-2B，尤其以SK-MES-1細胞中miR-127表達量最低。說明miR-127在肺鱗癌細胞癌變過程中可能也屬于功能性基因。這與李建波等[10]的研究結論基本一致。李建波等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-127在肺癌組織中的表達量較癌旁正常組織降低，并且隨著病理分期惡性程度的增高，降低更明顯；從而推斷miR-127對肺癌的增殖、轉移均有重要影響，有望成為肺癌早期診療的重要靶點。此外，阮鵬等[11]發(fā)現(xiàn)，化療抵抗的食管癌患者血清中miR-127水平顯著高于化療敏感患者，并通過多因素Logistic回歸分析，證實血清miR-127水平的升高可能是預測鼻咽癌患者化療抵抗的重要危險因素。基于上述研究事實，推測miR-127在腫瘤細胞化療耐藥過程中可能也發(fā)揮重要作用。

為了進一步證實該推斷的可靠性，我們選擇SK-MES-1細胞通過濃度梯度遞增法構建PTX耐藥細胞株。6個月后，最終獲得可在20 nmol/L PTX濃度下穩(wěn)定生長的耐藥細胞株SK-MES-1/PTX，并置于本院細胞實驗室的液氮罐中長期保存。通過實時熒光定量PCR法檢測，SK-MES-1/PTX耐藥細胞株中miR-127表達量較SK-MES-1細胞進一步降低，提示miR-127可能與肺鱗癌細胞化療耐藥的發(fā)生有一定關聯(lián)。因此，我們通過質粒轉染技術將miR-127 mimics轉染至SK-MES-1/PTX細胞中，上調miR-127表達，結果顯示，PTX對miR-127 mimics組SK-MES-1/PTX細胞增殖的抑制率和凋亡率均顯著升高，說明miR-127表達量下調可能是肺鱗癌細胞SK-MES-1對紫杉醇作用產(chǎn)生抗性的重要原因之一。

除此以外，我們通過TargetScan在線生物信息學軟件檢索發(fā)現(xiàn)，miR-127和KIF3B基因存在靶向互補序列，并通過雙熒光素酶報告基因分析，miR-127對KIF3B有一定的靶向調控作用。而且通過Western blot法檢測也證實，與SK-MES-1細胞相比，SK-MES-1/PTX細胞中miR-127表達量降低，KIF3B蛋白表達量上調。通過質粒轉染技術，上調miR-127 mimics組SK-MES-1/PTX細胞中KIF3B基因表達后，其對PTX的敏感性受到一定程度的抑制，說明miR-127可能通過抑制KIF3B基因轉錄過程，發(fā)揮抑癌基因的活性。

KIF3B驅動蛋白是一類能夠利用本身的自由能和ATP水解釋放的化學能等向微管發(fā)生定向運動的具有保守馬達結構的蛋白分子，一方面參與細胞組分的運輸，另一方面與染色體結構和有絲分裂過程中紡錘體的運動密切相關。早在本世紀初，趙健等[12]發(fā)現(xiàn)，驅動蛋白Rbkinesin-6在人肺腺癌細胞系A549的有絲分裂末期/胞質分裂最后階段發(fā)揮著關鍵作用，沉默Rbkinesin-6基因可以抑制A549細胞的增殖活性。Gan等[13]也證實，驅動蛋白KIF2C在非小細胞肺癌組織中呈高表達，且與患者高T分期、低-未分化、淋巴結轉移以及預后不良密切相關，而敲除KIF2C基因表達后，腫瘤細胞的增殖和遷移能力則顯著降低，而且通過雙熒光素酶報告基因顯示，miR-325對KIF2C可能具有一定的靶向調控作用。因此，驅動蛋白作為腫瘤治療靶點早已成為公認的事實，近幾年，以驅動蛋白為靶點的抗癌藥物研究也取得了長足進展[14]。但是多數(shù)研究只是針對驅動蛋白在肺癌細胞增殖、凋亡、異常有絲分裂、侵襲轉移等過程中的作用[15]，往往忽視其對腫瘤細胞化療耐藥的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，KIF3B驅動蛋白分子在肺鱗癌細胞SK-MES-1對PTX耐藥中也屬于功能性因子，從而為重新認識驅動蛋白家族的作用提供了新的思路。

綜上所述，對PTX耐藥的肺鱗癌細胞中miR-127表達量降低，KIF3B蛋白表達量升高，并且兩者之間存在一定的靶向調控關系。上調miR-127表達可增加SK-MES-1/PTX耐藥細胞對PTX的敏感性，其作用機制可能與抑制驅動蛋白KIF3B分子表達有關。