體內(nèi)外方法檢測(cè)化妝品用防腐劑的致敏性

張 明，袁 園，張麗霞，張宏偉，*

(1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所毒理室，北京 100021；2．浙江大學(xué)華南工業(yè)技術(shù)研究院化妝品創(chuàng)新研究中心，廣東 廣州 510535)

化妝品的安全性是由化妝品的原料決定的，而化妝品中的防腐劑是化妝品常用的原料，也是引起化妝品過(guò)敏反應(yīng)，即過(guò)敏性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的重要因素之一，化妝品過(guò)敏性接觸性皮炎是皮膚接觸致敏物質(zhì)后引發(fā)的遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。

由于國(guó)外對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)的禁令及對(duì)動(dòng)物替代試驗(yàn)的推行，皮膚致敏的檢測(cè)方法已開(kāi)發(fā)出一系列體外替代檢測(cè)方案[1]。其中經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)推薦的人類細(xì)胞系活化試驗(yàn)(human cell line activation test，h-CLAT)是檢測(cè)皮膚致敏過(guò)程中細(xì)胞表面分化抗原簇86(cluster of differentiation 86，CD86)和分化抗原簇54(cluster of differentiation 54，CD54)的表達(dá)來(lái)判定待測(cè)物是否具有致敏性，通過(guò)熒光染色測(cè)量人髓系白血病單核細(xì)胞(human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1)表面分子的表達(dá)來(lái)判定待測(cè)物是否具有致敏性。當(dāng)致敏物接觸THP-1細(xì)胞會(huì)引起其表面分子CD86和CD54的上調(diào)，說(shuō)明THP-1細(xì)胞被活化，發(fā)生了皮膚致敏過(guò)程。豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)(occluded patch test of Buchler，BT)是用受試物誘導(dǎo)過(guò)的動(dòng)物再次接觸同種受試物所表現(xiàn)出的皮膚反應(yīng)來(lái)判定受試物是否具有致敏性，該方法是國(guó)際上評(píng)價(jià)化學(xué)物皮膚致敏性的經(jīng)典方法，我國(guó)部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范也將該方法列為致敏性試驗(yàn)方法之一，對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行致敏性測(cè)試。h-CLAT 試驗(yàn)與BT試驗(yàn)相比，測(cè)試結(jié)果是否一致，本研究擬采用體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)和豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)對(duì)化妝品常用的2 種防腐劑進(jìn)行致敏性檢測(cè)，對(duì)比兩種方法檢測(cè)的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供的健康普通級(jí)白化豚鼠，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2018-0010，體質(zhì)量為300～350 g。將40 只動(dòng)物隨機(jī)分為受試物試驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.1.2 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)條件THP-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗、0.05 mmol/L β-巰基乙醇的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、β-巰基乙醇、雙抗、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自Sigma公司；Fc 段受體阻斷劑、7-氨基放線素菌-D(7-AAD)、FITC標(biāo)記小鼠單克隆CD86抗體、FITC標(biāo)記小鼠IgG1抗體、PE標(biāo)記小鼠單克隆CD54抗體、PE標(biāo)記小鼠IgG1抗體均購(gòu)自BD公司。

1.1.4 主要儀器流式細(xì)胞儀，型號(hào)FACS Calibur，購(gòu)自BD 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)GS-15R，購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀均購(gòu)自Thermo Scientific 公司；超聲儀、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、電熱恒溫水箱。

1.1.5 對(duì)照物和測(cè)試樣品BT試驗(yàn)和h-CLAT試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)采用 2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)，BT試驗(yàn)誘導(dǎo)和激發(fā)所用樣品分別為0.5%和0.1%的丙酮溶液，h-CLAT 試驗(yàn)中將其先溶解于少量DMSO 中，再用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到測(cè)試濃度，其中DMSO 在培養(yǎng)液中濃度不高于10%。陰性對(duì)照物質(zhì)甘油和測(cè)試樣品羥苯乙酯、羥苯丁酯均購(gòu)自Sigma公司。

BT 試驗(yàn)中用甘油溶解羥苯乙酯、羥苯丁酯，h-CLAT試驗(yàn)中將其溶解于少量DMSO中，再用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到各個(gè)測(cè)試濃度。

1.2 豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)[2]

按照1.1.1所述的動(dòng)物情況分組，受試物組給予的羥苯乙酯的誘導(dǎo)及激發(fā)濃度分別為50%和40%的甘油溶液，羥苯丁酯的誘導(dǎo)及激發(fā)濃度分別為0.5%和0.2%的甘油溶液。

試驗(yàn)前約24 h，將豚鼠背部左側(cè)用動(dòng)物電推剪去毛，去毛范圍為6 cm2。

誘導(dǎo)接觸：將上述配置好的受試物約0.2 mL涂在試驗(yàn)動(dòng)物去毛區(qū)皮膚上，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以醫(yī)用白色膠布封閉固定6 h，第7 和第14 天以同樣方法重復(fù)1 次。陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物用陽(yáng)性物質(zhì)(0.5%的2,4-二硝基氯苯的丙酮溶液)做同樣處理，陰性對(duì)照組動(dòng)物誘導(dǎo)時(shí)采用甘油。

激發(fā)接觸：末次誘導(dǎo)后14 d，將約0.2 mL的受試物涂于豚鼠背部右側(cè)2 cm×2 cm去毛區(qū)，試驗(yàn)前24 h去毛，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以醫(yī)用白色膠布固定6 h。陽(yáng)性對(duì)照組采用0.1%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液處理，陰性對(duì)照組分別采用40%羥苯乙酯的甘油溶液或0.2%羥苯丁酯的甘油溶液處理。

激發(fā)接觸后24 和48 h 觀察皮膚反應(yīng)，當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2，判為該動(dòng)物皮膚變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性，按表1判定受試物的致敏強(qiáng)度。

1.3 體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)[3]

1.3.1 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中水平培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，每隔3 d 進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。細(xì)胞使用前每隔24 h進(jìn)行活細(xì)胞染色計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞平均倍增時(shí)間，確定細(xì)胞穩(wěn)定性。細(xì)胞的使用不超過(guò)20代。

1.3.2 受試物細(xì)胞毒性檢測(cè)受試物溶解于少量DMSO 中，再用RMPI 1640 完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含0.05 mmol/L β-巰基乙醇、10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，pH=7.2)稀釋，2 倍稀釋配制6個(gè)濃度值。采用試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)方法檢測(cè)細(xì)胞毒性，細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的初始濃度培養(yǎng)2 d 后，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)/mL。取受試物溶液和細(xì)胞懸液各100 μL 混合接種至96 孔平底板上，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔。每次同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、溶劑對(duì)照(細(xì)胞和培養(yǎng)液1∶1 混合)、空白對(duì)照(除細(xì)胞外的其他介質(zhì))。將96孔板置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL的染液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。450 nm 波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度D(450)值。

細(xì)胞活性=[D(450)受試孔-D(450)空白孔]/[D(450)對(duì)照孔-D(450)空白孔]

通過(guò)受試物細(xì)胞毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)R 軟件分析處理，計(jì)算細(xì)胞存活率75%時(shí)的暴露濃度(75% cell viability，CV75)。

1.3.3 有效作用濃度計(jì)算對(duì)于具有致敏性的物質(zhì)，進(jìn)一步進(jìn)行有效作用濃度(effective concentration，EC)值的計(jì)算。對(duì)CD86計(jì)算EC150，即CD86的相對(duì)熒光強(qiáng)度(relative fluorescence intensity，RFI)達(dá)到150 時(shí)受試物的最低有效濃度。對(duì)CD54 計(jì)算EC200，即CD54 的RFI 達(dá)到200 時(shí)受試物的最低有效濃度。選取RFICD86＞150或RFICD54＞200的最低濃度作為CA(μg/mL)，RFICD86＜150或RFICD54＜200的最高濃度作為CB(μg/mL)。

CA為RFI≥150(CD86)或200(CD54)的最低濃度；CB為RFI＜150(CD86)或200(CD54)的最高濃度。RFIA為A濃度所對(duì)應(yīng)的RFI；RFIB為B濃度所對(duì)應(yīng)的RFI。

若所測(cè)濃度范圍內(nèi)RFI 均＞150(CD86)或200(CD54)，選用公式(3)計(jì)算EC150，選用公式(4)計(jì)算EC200。

CB為受試范圍內(nèi)最低濃度；CA為比RFIB大至少10%的RFI所對(duì)應(yīng)的最低濃度。

1.3.4 THP-1細(xì)胞CD86和CD54表達(dá)測(cè)定根據(jù)已經(jīng)測(cè)得的CV75值，結(jié)合細(xì)胞存活率介于65%～95%之間，1.2倍稀釋得到6個(gè)濃度。細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的初始密度培養(yǎng)2 d 后，離心調(diào)節(jié)濃度至2×106個(gè)/mL。取受試物和細(xì)胞各500 μL，1∶1 混合接種于24 孔板上。每次試驗(yàn)設(shè)立培養(yǎng)基對(duì)照、DMSO 溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(2.5 μg/mL 的DNCB)?？装逯糜诩?xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，用1 mL 的染色緩沖液清洗一次，進(jìn)行Fc段抗體封閉和7-AAD 染色10 min，再次清洗后進(jìn)行抗體染色(FITC-CD86、PE-CD54)和同型對(duì)照染色(FITC-IgG1、PE-IgG1)。染色完成后加入200 μL染色緩沖液清洗兩次，用500 μL的FACS緩沖液重懸細(xì)胞移至流式管中待用。用空白細(xì)胞和單染細(xì)胞調(diào)節(jié)電壓補(bǔ)償，按下式計(jì)算RFI。

熒光強(qiáng)度均值(mean fluorescence intensity，MFI)為熒光強(qiáng)度幾何平均數(shù)。

1.3.5 受試物致敏性判定化學(xué)物質(zhì)至少需要兩次獨(dú)立試驗(yàn)。每次試驗(yàn)要求細(xì)胞存活率大于50%，如果RFICD86≥150，則判定為CD86 表達(dá)陽(yáng)性；RFICD54≥200，則判定為CD54 表達(dá)陽(yáng)性。兩次試驗(yàn)中CD86 和CD54任一指標(biāo)兩次判定為陽(yáng)性，則判定該物質(zhì)具有致敏性。如果兩次試驗(yàn)CD86和CD54的表達(dá)均不具有一致性，則進(jìn)行第3 次試驗(yàn)。若第3 次試驗(yàn)中CD86 和CD54表達(dá)均為陰性，判定為非致敏物，否則判定該物質(zhì)具有致敏性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用R 軟件進(jìn)行分析，受試物羥苯乙酯組、羥苯丁酯組、陽(yáng)性對(duì)照DNCB 組和陰性對(duì)照甘油組的CD86與CD54的相對(duì)熒光強(qiáng)度值間的差異分析采用單因素分析進(jìn)行比較，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)，對(duì)化妝品常用的防腐劑羥苯乙酯、羥苯丁酯進(jìn)行了致敏性測(cè)試，于最后一次激發(fā)接觸后的24 h 和48 h 對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮膚觀察，結(jié)果見(jiàn)表2，其中陰性對(duì)照組致敏率為0，陽(yáng)性對(duì)照組DNCB 致敏率最低為40%，該試驗(yàn)成立，待測(cè)物羥苯乙酯對(duì)豚鼠的致敏率為0，羥苯丁酯在第24 h對(duì)豚鼠致敏率為45%，第48 h 時(shí)對(duì)豚鼠致敏率為30%，按表1 所列的致敏強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)，待測(cè)物羥苯乙酯為非無(wú)致敏物，羥苯丁酯為中等致敏物。

表2 受試物或?qū)φ瘴飳?duì)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(BT法)

2.2 體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果利用CCK-8 法對(duì)受試物質(zhì)羥苯乙酯、羥苯丁酯以及陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)DNCB 及陰性對(duì)照物質(zhì)甘油的細(xì)胞毒性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表3。其中陰性對(duì)照物質(zhì)甘油的CV75值大于5 000 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)DNCB 的CV75值為2.5 μg/mL，符合OECD 相關(guān)方法中的參考值范圍，該試驗(yàn)成立，待測(cè)物羥苯乙酯在測(cè)試濃度下的CV75值為126 μg/mL，羥苯丁酯在測(cè)試濃度下的CV75值為18 μg/mL。

2.2.2 CD86 和CD54 的有效作用濃度依據(jù)試驗(yàn)情況，選用1.3.3 所列公式，計(jì)算受試物的CD86 的最低有效濃度(EC150)及CD54的最低有效濃度(EC200)。兩次獨(dú)立平行試驗(yàn)中選取較高的EC150和EC200值作為最終值。

測(cè)試物質(zhì)致敏性的兩次測(cè)定結(jié)果的EC值見(jiàn)表4。

表3 受試物質(zhì)細(xì)胞毒性CV75值

表4 測(cè)試物質(zhì)的EC150和EC200值

2.2.3 測(cè)試物質(zhì)CD86 和CD54 的相對(duì)熒光強(qiáng)度值參考上述試驗(yàn)中CV75值，在細(xì)胞存活率65%～95%范圍內(nèi)，選取6 個(gè)劑量，測(cè)得待測(cè)物質(zhì)的CD86 和CD54 的相對(duì)熒光強(qiáng)度和細(xì)胞活率，具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 測(cè)定樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度值

2.3 BT試驗(yàn)與h-CLAT試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

將上述豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)與體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)獲得的各個(gè)化學(xué)物質(zhì)的致敏強(qiáng)度結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 BT法與h-CLAT試驗(yàn)測(cè)試致敏性結(jié)果

3 討 論

歐盟現(xiàn)行化妝品法規(guī)第1223/2009 號(hào)條例于2009年頒布，2013年7月全面生效，取代1976年頒布的歐盟化妝品的理事會(huì)76/768/EEC指令，成為歐洲化妝品行業(yè)的統(tǒng)一法規(guī)，新法規(guī)繼續(xù)保留了禁止動(dòng)物試驗(yàn)的規(guī)定，加強(qiáng)替代方法的研發(fā)投入與支持，鼓勵(lì)替代方法的運(yùn)用，將成為未來(lái)對(duì)藥品、化妝品安全性評(píng)價(jià)的主要趨勢(shì)。

歐洲替代方法研究中心(ECVAM)已完成對(duì)h-CLAT 試驗(yàn)的可行性 驗(yàn) 證，2015 年12 月，OECD 已經(jīng)公布了該方法草案，并于2016年正式列為OECD的毒理學(xué)測(cè)試方法。Ashikaga 等[4]通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞CD86 和CD54 的表達(dá)水平對(duì)100 種化學(xué)物的致敏性進(jìn)行了判定，h-CLAT 與小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果的一致性可達(dá)84%，h-CLAT 不僅能分辨出極強(qiáng)度致敏和強(qiáng)致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等[5]發(fā)現(xiàn)受試物經(jīng)過(guò)暴露48 h后，可以用h-CLAT 法通過(guò)分析THP-1細(xì)胞CD86的表達(dá)水平將23種致敏物質(zhì)的22種鑒定出來(lái)，結(jié)合CD86 和白細(xì)胞介素-8 的分析對(duì)致敏物可做綜合判斷。

羥基苯酯類是世界上使用廣泛的防腐劑，其中羥苯乙酯，羥苯丁酯是常見(jiàn)的化妝品用防腐劑，隨著人們，尤其是女性消費(fèi)者對(duì)化妝品的使用量日趨上升，其對(duì)人們的皮膚及其身體健康的影響亦受到越來(lái)越多的關(guān)注，由化妝品引起的皮膚致敏性是重要關(guān)注點(diǎn)。本研究選用體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)和豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)測(cè)試化學(xué)物的皮膚致敏性，兩種方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均做出正確判斷，說(shuō)明試驗(yàn)方法可靠。體外人細(xì)胞系活化試驗(yàn)檢測(cè)兩種化妝品防腐劑均為致敏陽(yáng)性，羥苯乙酯為弱致敏物，羥苯丁酯為強(qiáng)致敏物。利用體外方法檢測(cè)羥苯脂類的致敏性文章報(bào)道不多，2015 年Sonnenburg 等[6]采用體外培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞檢測(cè)羥苯脂類的致敏性，結(jié)果顯示羥苯乙酯為弱致敏，羥苯丁酯為強(qiáng)致敏，盡管與本實(shí)驗(yàn)采用的測(cè)試細(xì)胞系不同，兩者的檢測(cè)結(jié)果相一致。利用h-CLAT 試驗(yàn)方法，通過(guò)測(cè)定CD86 和CD54 的表達(dá)對(duì)羥苯乙酯，羥苯丁酯的致敏性測(cè)試，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)檢測(cè)羥苯乙酯為非致敏物，羥苯丁酯為中度致敏物。由于國(guó)外近年來(lái)禁止動(dòng)物試驗(yàn)，采用豚鼠進(jìn)行的測(cè)試，多是較早期的報(bào)道，1952年Sokol[7]利用豚鼠皮下注射方法，對(duì)羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯4 種物質(zhì)的測(cè)試結(jié)果顯示，4種物質(zhì)均未出現(xiàn)致敏性。

上述兩種方法檢測(cè)皮膚致敏性，采用的方式和原理不同，豚鼠法是模擬人體經(jīng)皮膚接觸化學(xué)物后引起致敏的全過(guò)程，含有測(cè)試物質(zhì)需要透皮的環(huán)節(jié)，而體外細(xì)胞方法是通過(guò)對(duì)皮膚致敏過(guò)程中CD86和CD54表達(dá)的測(cè)定從而來(lái)判定受試物是否具有致敏性。從施用方式上而言，前者更接近與人體接觸的真實(shí)情況，但動(dòng)物試驗(yàn)也存在種屬差異的問(wèn)題，本研究的體內(nèi)試驗(yàn)未采用二次激發(fā)觀察致敏情況，也可能是其敏感性及檢出率低的原因，在后期將對(duì)此進(jìn)一步研究、探討。h-CLAT 試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞方法測(cè)試，雖然檢測(cè)特異性高，但也不排除假陽(yáng)性的可能。此外，兩種方法致敏強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同，可能導(dǎo)致同一物質(zhì)采用不同的試驗(yàn)方法，結(jié)果被判定為強(qiáng)或弱的等級(jí)不完全一致。

如上所述，許多研究者認(rèn)為，目前單一體外替代方法不能完全替代動(dòng)物試驗(yàn)，單一方法可以作為篩選性試驗(yàn)，應(yīng)采用更多的組合策略對(duì)致敏性進(jìn)行測(cè)試。