土壤和大米中得克隆檢測方法的研究

謝慧，常曉云，馬鈺涵，王玉瑩

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，山東 泰安271018；2.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 泰安271018）

高氯代阻燃劑得克?。―echlorane plus，簡稱DP，C18H12C112），即雙（六氯環(huán)戊二稀）環(huán)辛烷，是一種高產(chǎn)量化學(xué)品添加劑，用于計算機顯示器、電視、家具和電線涂層中的電硬塑料連接器中，其存在兩種異構(gòu)體，分別為順式得克?。╯yn-DP）和反式得克?。╝nti-DP）（比例約為1∶3）[1]。DP 具有遠(yuǎn)距離傳輸性[2]、生物富集性[3-5]和難降解性等持久性有機污染物（POPs）特性[6]，因此環(huán)境中較低濃度的DP殘留也會對生物有較大的影響[7-8]。DP使用量巨大，使用范圍較廣，在全球各環(huán)境介質(zhì)中普遍存在[9-12]，因此建立土壤和水稻中痕量DP的殘留檢測方法具有重要意義。

建立高特異性、高靈敏度的分析方法成為DP 研究領(lǐng)域的關(guān)鍵，檢測DP 在各種環(huán)境介質(zhì)中的含量水平，也是各項相關(guān)研究工作得以開展的基礎(chǔ)。已有的研究采用氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法（GC-NCIMS）檢測環(huán)境中DP 類污染物[13-15]，NCI 選擇性較低，易受基質(zhì)干擾[16]；Xu 等[16]采用加速溶劑萃?。ˋSE）儀對土壤樣品中的DP進行提取，硅膠層析柱凈化濃縮，GC-NCI-MS 進行測定；Zhu 等[17]采用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-APCI-MS/MS）測定水中的DP；何暢等[18]采用正己烷-二氯甲烷混合液利用索氏提取器提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，GC-MS（氣質(zhì)聯(lián)用）法測定空氣中的DP；劉合歡等[19]建立了利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測DP 及其相關(guān)化合物在土壤樣品中含量的方法。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，雖然有不少關(guān)于DP殘留的測定方法，但是由于谷物中的DP殘留量很低，利用兩種不同的提取方法，并結(jié)合EI 離子源和GC-MS/MS 的二級質(zhì)譜檢測方法檢測谷物樣品中DP殘留的測定方法的報道還較少。

本研究采用振蕩提取和加速溶劑萃?。ˋSE）兩種預(yù)處理方法，利用EI 離子源和GC-MS/MS 的二級質(zhì)譜檢測方法，建立了土壤和大米中痕量DP 的GCMS/MS 的殘留測定方法，能有效減少基質(zhì)干擾，提高DP分析的選擇性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

DP 標(biāo)準(zhǔn)品（純度100%，Accu Standard Inc 公司）、syn-DP 標(biāo)樣和anti-DP 標(biāo)樣（Accu Standard Inc 公司，甲苯配制）、正己烷（色譜純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、二氯甲烷（色譜純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、無水硫酸鈉（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、硅膠（180～280目，克拉瑪爾公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000 三重四極桿GC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific）、ASE 150（Dionex）、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-ⅢB 循環(huán)水式多用真空泵（浙江臨海市精工真空設(shè)備廠）、萬分之一電子分析天平（梅特里，Mettler-Toledo Group）和移液管、SampliQ SPE-C18固相萃取小柱、玻璃棒、容量瓶、250 mL碘量瓶、布氏漏斗、平底燒瓶等玻璃器皿。

1.3 供試材料

供試土壤采于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗農(nóng)場，采樣深度為2～20 cm，取適量土壤于干凈托盤上自然風(fēng)干后，過40 目篩裝袋備用。大米購自農(nóng)貿(mào)市場，粉碎后待用。

1.4 DP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用萬分之一天平稱0.002 0 g DP（syn-DP 和anti-DP）標(biāo)準(zhǔn)樣品于50 mL容量瓶，用正己烷溶解定容，配得400 mg·L-1的DP母液，再分別配制各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：16、8、4、1.6、0.8、0.4、0.16、0.04 mg·L-1和0.008 mg·L-1，通過外標(biāo)法進行定量分析。syn-DP 和anti-DP 的單標(biāo)溶液均為甲苯配制的50 mg·L-1的液體標(biāo)樣，采用正己烷稀釋到0.05 μg·mL-1，進行定性分析。

1.5 土壤和大米中DP的提取凈化方法

振蕩提取法：稱取風(fēng)干過篩的土壤（粉碎的大米樣品）樣品25.00 g 到250 mL 碘量瓶中，添加DP 標(biāo)準(zhǔn)溶液至試驗設(shè)定的濃度，在室溫下平衡12 h 后，加入70 mL 的正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V），在振蕩器上振蕩提取1 h后，用布氏漏斗減壓抽濾，用30 mL 正己烷分3次沖洗碘量瓶和濾渣，每次使用10 mL，合并濾液并經(jīng)無水硫酸鈉干燥后濾入250 mL 的平底燒瓶，所有萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于60 ℃下濃縮至1～3 mL，過硅膠柱層析凈化。層析柱從下往上依次加入無水硫酸鈉20.00 g、氧化鋁（7.5%失活）5.00 g、硅膠（3%失活）3.00 g 和無水硫酸鈉20.00 g。用20.00 mL 正己烷預(yù)淋洗，將上述濃溶液轉(zhuǎn)移至層析柱中，用100 mL 正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）混合液洗脫，收集全部淋洗液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1～2 mL，然后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，正己烷定容，用0.22 μm 有機相濾膜過濾，待上機檢測。添加濃度分別為0.005、0.05、0.5、2.5、5.0 mg·kg-15 個水平于空白的土壤樣品中，添加濃度分別為0.001、0.01、0.05、0.25、0.5 mg·kg-15 個水平于空白的大米樣品中，同時設(shè)置空白對照（不添加DP），每個處理設(shè)置5個平行樣。

ASE：準(zhǔn)確稱取土壤（大米）樣品10.00 g，加入3 g硅藻土作為分散劑，混合均勻，裝入ASE 150 樣品池中，樣品池的頂部和底部各墊一層玻璃纖維濾膜（美國Dionex 公司），防止土壤和硅藻土阻塞管路。添加DP 標(biāo)準(zhǔn)溶液至一定濃度，平衡過夜后，加10 mL 正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V），在100 ℃、10.34 MPa 下萃取10 min，萃取液直接過SampliQ SPE-C18固相萃取小柱凈化，凈化后溶液定容到10 mL 進行測定。樣品中DP的添加濃度同振蕩提取法。

1.6 儀器分析條件

TSQ 8000 三重四極桿GC-MS/MS：色譜柱采用DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm id，膜厚0.25 μm）；初始溫度為140 ℃，保持1 min，15 ℃·min-1升至285 ℃，保持1 min，60 ℃·min-1升至325 ℃，保持7 min；進樣口溫度為280 ℃，傳輸線和離子源的溫度分別為280 ℃和290 ℃。氦氣流速為1.0 mL·min-1，采用不分流模式進樣1 μL，EI電離源，離子模式（SIM）進行定量分析。在該條件下，syn-DP 和anti-DP 的保留時間分別為15.41 min和15.92 min。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

樣品的回收率采用SPSS 22.0 進行顯著性分析，采用單因素方差分析（ANOVA），通過P＜0.05 的最小顯著性差異（LSD）評價不同處理間回收率的差異顯著性。方法的最小檢出濃度采用公式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系與靈敏度

DP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1 可知，syn-DP 和anti-DP 的線性方程為y=9.585 9x+0.165 8 和y=11.899x+1.305 6，相關(guān)系數(shù)r均為0.999 5，線性范圍分別在5.00×10-13～4.02×10-9g 和1.62×10-12～1.30×10-8g之間，線性關(guān)系良好，線性范圍較寬。在1.6 檢測條件下分別進樣濃度均為0.1 μg·L-1的syn-DP 1 μL 和anti-DP標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 μL，在信噪比為3的條件下，測得syn-DP 和anti-DP 最小檢出量分別為1.00×10-13g和5.0×10-14g；土壤中syn-DP 和anti-DP 方法的最小檢出濃度均為4.0×10-5mg·kg-1，大米中syn-DP 和anti-DP方法的最小檢出濃度均為1.0×10-4mg·kg-1。

圖1 順式得克隆和反式得克隆的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of syn-DP and anti-DP

2.2 DP的總離子流圖

采用GC-MS/MS 檢測分析，DP 的標(biāo)樣和在土壤與大米樣品中測定的總離子流圖如圖2所示。

如圖2 所示，在試驗設(shè)定的測定條件下，DP 的兩個異構(gòu)體syn-DP 和anti-DP 的保留時間分別為15.41 min和15.92 min，anti-DP與syn-DP峰分離效果很好，而且峰形很好，均為尖頭峰，沒有拖尾和其他不良現(xiàn)象。在采用TSQ8000 三重四極桿GC-MS/MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測下，土壤和大米中較低添加濃度的DP 的總離子流圖的雜質(zhì)峰很少，沒有明顯干擾物質(zhì)存在，說明本試驗采用的檢測條件適合分析土壤和大米中DP的殘留。

圖2 得克隆的總離子流圖Figure 2 Total ion chromatograms of DP

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

2.3.1 DP在土壤中的添加回收率

以DP在土壤中的添加回收率來衡量本試驗方法的準(zhǔn)確度，以變異系數(shù)（CV）表示方法的精密度，測得不同濃度下DP的添加回收率見表1。

由表1 可知，采用振蕩提取和ASE 兩種不同的樣品前處理方法處理土壤樣品時，DP 的兩種異構(gòu)體syn-DP 和anti-DP 在土壤中的添加回收率均能達(dá)到殘留分析方法的要求，ASE方法回收率略高于振蕩提取方法，并且ASE 方法簡單、快速。對于syn-DP，在試驗設(shè)定的添加濃度下，振蕩提取和ASE方法添加回收率分別為85.32%～91.42%和90.69%～95.63%，變異系數(shù)均小于4.64%；對于anti-DP，在試驗設(shè)定的添加濃度下，振蕩提取和ASE 方法添加回收率分別為82.45%～90.16%和88.78%～98.23%，變異系數(shù)均小于4.96%。

2.3.2 DP在大米中的添加回收率

測得不同濃度下大米中DP的添加回收率結(jié)果見表2。由表2 可知，采用振蕩提取和ASE 兩種不同的樣品前處理方法處理大米樣品，syn-DP 和anti-DP 在大米中的添加回收率均能達(dá)到殘留測定方法的要求，加速溶劑萃取儀因其加壓使溶劑在高溫下保持液態(tài)，并使萃取劑快速填滿萃取池的特點，具有提取效率高、速度快和有機溶劑使用量少的優(yōu)點，回收率分別為90.56%～98.56%和90.36%～96.56%，變異系數(shù)均小于5.05%，滿足了痕量syn-DP 和anti-DP 殘留分析方法的要求。振蕩提取法因操作繁瑣導(dǎo)致DP 在樣品預(yù)處理中損失較多，回收率小于ASE 法，回收率分別為86.47%～90.24%和85.84%～89.61%，變異系數(shù)均小于4.53%。采用SPSS 22.0 對兩種提取方法的回收率進行差異顯著性分析，結(jié)果表明添加較低濃度的處理具有顯著差異，而添加較高濃度的處理無顯著差異。

表1 syn-DP和anti-DP在土壤中的添加回收率Table 1 The recovery rate of syn-DP and anti-DP in the soil

表2 syn-DP和anti-DP在大米中的添加回收率Table 2 The recovery rate of syn-DP and anti-DP in the rice

2.4 實際樣品的測定

利用本文建立的樣品預(yù)處理方法和測定方法檢測了盆栽試驗中的土壤和大米中的殘留量，土壤中syn-DP 和anti-DP 殘留濃度分別為0.58 mg·kg-1和1.76 mg·kg-1，種植的水稻收獲后測定大米中syn-DP和anti-DP殘留量分別為0.28 ng·g-1和0.79 ng·g-1。

3 討論

在樣品前處理中，DP 與其他親脂性有機化合物如多溴二苯醚和多氯聯(lián)苯（PCBs）的方法相似，一般包括樣品采集/預(yù)處理、樣品提取、凈化和儀器分析4步。氣體中的DP 采用聚氨酯泡沫（PUF）[20]和XAD-2樹脂收集，空氣中的顆粒物采用石英fiber filter 收集；水樣采用XAD[21]、PAD（苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物）樹脂或琥珀玻璃作為收集介質(zhì)，魚等生物樣品需要先進行均質(zhì)化，才能獲得具有代表性的樣品[22]；底泥中的DP采用Tenax提取方法[23]；土壤和植物樣品利用二氯甲烷采用索氏提取法進行提取[24]，萃取溶劑為丙酮、二氯甲烷[25]、正己烷、甲苯和二乙醚等[19]，根據(jù)樣品類型的不同，可采用液-液萃取[25]、固-液萃取[11]、索氏萃取[2]和ASE 等多種萃取技術(shù)。萃取溶劑需要凈化，一般采用簡單的硅膠或氧化鋁柱、復(fù)雜的多層和多吸附劑柱，對于生物樣品，去除萃取物中的脂類和其他物質(zhì)，凝膠滲透色譜法（GPC）[4]是最常用的方法，硫化法[21]也能破壞油脂含量。本研究利用混合有機溶劑正己烷/二氯甲烷（1∶1，V/V）提取，采用振蕩提取和ASE 兩種方法分別提取，采用SPE 小柱凈化，滿足了樣品中DP殘留分析方法的要求。本研究采用的振蕩提取法是傳統(tǒng)的樣品前處理方法，雖操作費時但一般實驗室都能具備該提取條件，ASE為樣品前處理的先進設(shè)備，價格昂貴但提取效率高，滿足了現(xiàn)代化實驗室的需要。

Hoh 等[21]和Zhu 等[12]在syn-DP 和anti-DP 商業(yè) 化之前采用商品化的DP 作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，而本研究利用甲苯配制的單標(biāo)syn-DP 和anti-DP 分別進行定性分析，能更準(zhǔn)確地檢測分析。DP可采用GC-ECNCI-MS進行檢測分析[20，26-27]，用甲烷氣體電離，為了提高方法的靈敏度，可采用選擇性離子監(jiān)測（SIM）模式進行數(shù)據(jù)采集（質(zhì)荷比m/z為651.8 和653.8）[28]；氣相色譜配電子捕獲檢測器（GC-ECD）也能檢測DP，Kang 等[29]利用了電子碰撞模式下的高分辨率質(zhì)譜（GC-HRMS）進行檢測，Zhou 等[30]采用液相色譜-大氣壓光電離串聯(lián)質(zhì)譜法分析了魚體中36 種鹵代阻燃劑（包括DP）。本研究利用EI 離子源和GC-MS/MS 的二級質(zhì)譜檢測方法檢測分析了土壤和大米樣品中DP 的兩種異構(gòu)體，靈敏度很高，非常適合痕量DP的檢測分析。

4 結(jié)論

（1）采用振蕩提取和加速溶劑萃取兩種方法對土壤和大米中得克隆殘留進行提取，利用TSQ 8000 三重四極桿GC-MS/MS的二級質(zhì)譜檢測分析，建立了土壤和大米中得克隆的殘留測定方法。

（2）得克隆的兩種同分異構(gòu)體syn-DP 和anti-DP在本測定條件下保留時間分別為15.41 min 和15.92 min，線性范圍比較寬（102），LOD 分別為1.00×10-13g和5.0×10-14g，土壤中syn-DP 和anti-DP 方法的最小檢出濃度均為0.40×10-4mg·kg-1，大米中syn-DP 和anti-DP方法的最小檢出濃度均為1.0×10-4mg·kg-1。

（3）syn-DP 和anti-DP 在土壤和大米中的添加回收率，快速溶劑萃取法均大于振蕩提取法，在兩種處理方法下，二者的回收率均能滿足土壤和大米樣品中得克隆痕量殘留檢測分析方法的要求。